[发明专利]一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒：基于PCR技术，以肉牛(郏县红牛)的血液基因组DNA池为模板，利用特异引物对P1扩增牛PLAG1基因的Indel位点，然后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果将不同个体分为缺失型、正常型以及杂合型，本发明提供的方法建立在肉牛PLAG1基因Indel位点与生长性状之间的关联性基础上，方法不仅简单，快速，便于推广应用，而且有利于加快肉牛分子标记辅助选择育种工作。

技术领域

本发明属于分子遗传学研究领域，具体涉及一种检测肉牛(郏县红牛)PLAG1基因Indel标记的方法，该方法利用基因组DNA进行PCR，然后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果分型。

背景技术

遗传学标记在遗传学的建立和发展过程中具有举足轻重的作用，随着遗传学的进一步发展和分子生物学的异军突起，遗传标记先后相应经历了形态标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记四个发展阶段。前三个阶段是以基因表达的结果为基础的，是对基因的间接反映。而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映，能够直接反映DNA分子水平上的差异，再加之其多态性高、数量多，且标记表现为显性或共显性，因而其理论与应用价值不可估量。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

插入/缺失(insertion-deletion,InDel)是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失，即一个序列上某一位点相比同源的另一个序列插入或缺失了一个或多个碱基(Weber et al,2002)。InDel是同源序列比对产生空位(gap)的现象，但大多数情况下无法获知祖先序列(Fan et al,2007)，很难判断空位位点是哪个序列发生了插入突变，或哪个序列发生了缺失突变，所以一般统称它们为插入/缺失突变。InDel标记基于PCR扩增技术，本质上属于长度多态性标记(Hytenet al,2010)。InDel标记因其稳定性好、多态性高、分型系统简单(Jander et al,2002)，开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。

根据InDel的大小，可将其分为3类：(1)小InDel：1-543nt；(2)微InDel：50nt；(3)结构变异：10,000nt。不同种类的InDel产生机制不同。微InDel通常是由于模板或引物“打滑”造成的，结构变异通常是大片段的插入/缺失，其产生机制与拷贝数变异类似。基因组结构变异主要通过四种机制产生：非等位同源重组、非同源末端连接、复制叉停滞与模板交换及通过L1介导的反转录转座。

沃森和克里克描述DNA双螺旋的结构后不久，Fresco和Alberts描述了含有不成对核苷酸的双链DNA分子模型。随后，Streisinger等提出了现在的经典假设，即移码突变由重复DNA序列中的链滑移导致，从而产生含有最终插入或缺失的不成对碱基的错配中间体。

InDel标记是基于基因组中插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记，目前大多是利用电泳平台进行分型，该分型平台快捷经济，不需要复杂的实验设备，可操作性强。电泳分型平台有琼脂糖凝胶电泳、变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及毛细管电泳。当InDel位于某种限制性内切酶的酶切位点上时，可转化为扩增片段酶切长度多态性(CAPS)，先用该限制性内切酶酶切后再电泳分型(KoniecznyAusubel,1993)。InDel长度变化较大，选择InDel位点时，应优先选择多态性差异5-20bp的InDel，这类InDel引物设计的成功率高，而且便于检测。为了节约高通量分型检测成本，Salathia等(2007)利用InDel阵列对拟南芥Landsbergerecta与Columbia两种生态型进行InDel分型，通过比较基因组杂交精确分析InDel多态性。也有研究利用测序技术进行InDel分型，错误率远低于1％(Bhangale et al,2005)，但成本偏高。