[发明专利]一种基于液相色谱-质谱联用的高覆盖脂质组学分析方法

权利要求书

1.一种基于液相色谱－质谱联用的高覆盖脂质组学分析方法，其特征在于：①利用超高效液相色谱/组合型四级杆-轨道阱质谱的数据依赖采集模式自动采集由多种类型样品提取制作的单独或混合样本中所含脂质代谢物的二级质谱；②采用定性分析软件从二级质谱数据中提取所测得脂质的保留时间、母离子及其子离子信息；根据脂质质谱结构特征筛选母离子对应的特征子离子，构成特征离子对；将不同类型样本中得到的特征离子对信息加和；根据脂质数据库及脂质结构特征，对脂质离子对扩充，利用色谱保留规律对扩充的脂质离子对进行保留时间预测，并将其与实测样本中的离子对合并，得到总的脂质特征离子对库；③根据脂质特征离子对库的保留时间和特征离子对信息，对实际待测的所有生物样本进行高覆盖脂质组学分析；首先利用构建的超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测方法在正、负离子模式下对单个样本或2个以上样本混合的质量控制样本进行单针或多针采集，获得该样本中的有效脂质特征离子对，即与脂质离子对库比对中重合的离子对； ④利用超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测在正、负离子模式下对单个待测生物样本仅对有效脂质特征离子进行扫描，获得相应的谱图，再通过定量分析软件进行峰面积积分，得到待测样品中脂质代谢物及其定量信息；

单独或混合样本的制备及其所含脂质代谢物二级质谱的获取步骤如下，

选择不同类型的样品基质，包括但不限于人或动物的组织、细胞、血浆或血清、或植物的组织或细胞中的一种或多种；

对样本进行脂质提取，其提取体系是氯仿-甲醇-水体系或甲基叔丁基醚-甲醇-水体系，得到供色谱/质谱分析的进样溶液；

提取剂中加入8个外源代谢物PC38:0，LPC19:0，TG45:0，PE34:0/PE30:0，FFA16:0-d3，FFA18:0-d3，Cer35:1，SM30:1作为内标，用于色谱保留时间校正；

单独或混合样本是指将各类型样品的进样溶液单独或等体积混合；

利用超高效液相色谱/组合型四级杆-轨道阱质谱的数据依赖采集模式自动采集合并各样本所含脂质代谢物的二级质谱；

高覆盖脂质组学分析方法建立步骤如下，

1）采用不同类别脂质标样混合物，优化每类脂质特征离子对的质谱去簇电压和碰撞能，作为该类脂质的最佳质谱条件；

2）将脂质特征离子对库中的母离子、子离子、保留时间及优化的去簇电压和碰撞能输入到超高效液相色谱/三重四级杆质谱工作站；

3）如果质谱同一时间，输入超高效液相色谱/三重四级杆质谱工作站的特征离子对数目大于200个，则增加超高效液相色谱/三重四级杆质谱采集针数；使得每个超高效液相色谱/三重四级杆质谱方法，均保证同一时间，采集的特征离子对不超过200个。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：脂质特征离子对库的构建步骤如下，

利用定性软件，Thermo Xcalibur Qual Browser和LipidSearch中一种或二种提取各样本所测得脂质代谢物的保留时间、校正保留时间、母离子、子离子信息；

根据脂质的质谱结构特征筛选母离子对应的特征子离子，进而构成特征离子对；

将各样本中得到的特征离子对加和，所述加和是指在任一样本中出现一次的特征离子对都作为一个最终的特征离子对，而在多个样本中均出现的离子对仅作为一个特征离子对；

根据脂质数据库Lipid Maps及脂质质谱结构特征，扩充脂质特征离子对；所述扩充是指在实际样本中检测出的脂质基础上，进一步增加每类脂质的数目，而不涉及脂质类别的增加；

基于实测脂质的保留时间及色谱保留规律，对扩充脂质离子对进行保留时间预测，将其与实测样本中的特征离子对合并，得到总的脂质特征离子对库；所述色谱保留规律是指脂质的保留时间与碳数、保留时间与碳-碳双键数间的对应关系。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：实际待测生物样本的高覆盖脂质组学分析，具体步骤如下，

1）将建立的超高效液相色谱/三重四级杆质谱采集方法用于单个样本或质量控制样本分析；每个方法均对质量控制样本重复3次分析，与脂质特征离子对库比对，离子对出现至少2次且校正保留时间与特征离子对库中的校正保留时间偏差≤0.5min，视为有效离子对；所述质量控制样本是由2个以上待分析样品等体积混合制备而成；

2）实际样本采用与质量控制样本相同的超高效液相色谱/三重四级杆质谱联用方法，采用动态多反应监测模式，仅采集有效离子对，获得样品对应的谱图；再通过定量分析软件进行峰面积积分，得到待测样品的脂质代谢物及其定量信息。