[发明专利]一种基于液相色谱-质谱联用的高覆盖脂质组学分析方法

说明书

本发明公开了一种基于液相色谱‑质谱联用的高覆盖脂质组学分析方法。基于多种类型基质提取制作单独或混合样本，利用超高效液相色谱‑高分辨质谱数据依赖采集模式自动采集合并各样本脂质代谢物的二级质谱，采用定性分析软件提取脂质保留时间、母离子及其子离子信息；根据脂质质谱结构特征筛选母离子对应的特征子离子，得到特征离子对；将不同类型样本得到的特征离子对信息加和，进一步根据脂质数据库、脂质结构特征以及色谱保留规律对脂质离子对进行扩充，得到最终的脂质离子对库。利用UPLC‑QQQ‑MS通过动态多反应监测模式对脂质离子对进行扫描。与传统非靶向脂质组学分析方法相比，本发明具有更好的重复性、脂质覆盖度。

技术领域

本发明涉及分析化学、生物化学和医学领域，是一种基于超高效液相色谱/三重四级杆质谱联用的采用动态多反应监测模式进行高覆盖脂质组学分析的方法。

背景技术

脂质是细胞膜的重要组成部分，在细胞的信号传导、物质运输、能量储存等方面发挥重要的作用。脂质代谢异常与众多疾病如肥胖、高血压、糖尿病、心血管疾病、帕金森、癌症等的发生发展密切相关。脂质组成繁多，结构复杂，人体内脂质高低含量的差别高达6～7个数量级。因此，建立可靠、稳定、高覆盖、高灵敏的脂质代谢物分析方法对研究与脂代谢紊乱相关疾病的生理、病理具有积极的指导意义。脂质组学技术致力于通过分析复杂生物样本中尽可能多的脂质代谢物及其受到外界刺激/扰动后所发生的变化来研究与脂质代谢表型相关的生物现象及其功能。近年来，已被广泛应用于相关疾病的研究，用于发现与疾病预防及诊断相关的脂质标记物，为疾病的发生、发展机理及药物疗效的评价提高理论依据。常用的脂质组学分析方法主要有基于质谱技术的直接进样法即“鸟枪法”和基于色谱－质谱的联用技术。“鸟枪法”，分析通量高，但离子抑制问题明显，不利于低丰度及同分异构脂质的分析检测。基于色谱－质谱联用的脂质组学分析技术由于具有质谱检测前的色谱预分离过程，可大大减少离子抑制，提高检测灵敏度，改善痕量脂质及同分异构脂质代谢物的分离检测。

目前脂质组学的分析策略主要分为两种：非靶向分析和靶向分析。非靶向脂质组学分析是基于质谱技术的一种常用的脂质分析方法，只需将样本按照一定的步骤进行预处理，利用质谱的全扫描模式及数据依赖模式的二级离子扫描对待测样品分析，再利用软件对采集的全扫描谱图进行峰匹配，得到包含质荷比(m/z)，保留时间(色谱-质谱联用)及强度等信息的峰表，然后根据二级谱图及准确质量数对m/z进行归属；也可利用商业化的脂质定性软件，先对采集的二级谱图进行定性，再根据定性结果通过脂质定量软件对全扫描谱图进行靶向提取，得到脂质代谢物、保留时间(色谱-质谱联用)及强度等信息的峰表。通过多变量或单变量统计分析找出差异脂质代谢物，并进行进一步的生物学解释。非靶向脂质组学分析常用的质谱是高分辨的飞行时间质谱、四级杆-飞行时间串联质谱、四级杆-静电轨道阱串联质谱以及傅里叶变换-离子回旋共振质谱等，具有较高的质量准确度，利于脂质结构鉴定。但非靶向方法存在一定的局限性：如由于同时进行很宽范围的扫描，导致同时检测的离子数过多，使得质谱的线性响应较差，低丰度脂质难以检测，定量准确性也会受到影响；另外后续数据处理繁琐，峰匹配过程易受峰匹配参数的影响，会引入误差，由于匹配算法的局限，往往会得到错误的结果，影响数据的准确性，使得不同批次的数据难以重复。尽管商业化脂质定性、定量软件可利用脂质的一级、二级信息，直接给出脂质的定性定量结果，一定程度上提高了数据的准确性，但脂质定性软件高度依赖二级谱图，只能对有二级碎裂的脂质进行定性，导致多数丰度较低、没有二级碎裂的脂质信息会被掩盖。

靶向脂质组学分析是基于质谱的另一种常见的脂质分析策略。通常采用用三重四级杆，通过多反应监测模式进行检测。三重四级杆多反应监测时，第一个四级杆选择脂质的特征母离子，第二个四级杆相当于碰撞池，将选定的母离子在一定电压下碎裂，第三个四级杆则选择待测脂质的特征子离子。靶向脂质组学分析，线性范围宽，可以最大程度满足样品中脂质的检测；选择性高，基质干扰小，灵敏度高，有利于痕量物质的检测；重复性好，数据质量高，不同批次间具有可比性，适合大规模样品分析；另外，由于离子对是预设的，无需峰匹配。但靶向脂质组学分析针对的是具有重要生物功能的某一类脂质代谢物或特定通路上的关键脂质代谢物，检测的脂质数目有限，难以满足脂质组学中检测尽可能多的脂质代谢物的需求。