[发明专利]荧光素酶报告基因法猪干扰素α生物学活性检测方法

权利要求书

1.一种荧光素酶报告基因法猪干扰素α生物学活性检测方法，其包括以下步骤：

采用PCR扩增获取猪Mx1蛋白的pMx1的基因片段；

将PCR扩增获得的猪Mx1蛋白的pMx1的基因片段插入pGL3-basic载体luc基因的5'端，再采用PCR扩增得到pMx1-luc融合基因片段；

用pMx1-luc融合基因片段替代pEGFP-N1载体中的pCMV和EGFP的基因片段，构建pMx1-luc质粒；

用pMx1-luc质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株；

对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养；

以梯度稀释的猪干扰素α标准品制备标准曲线，确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系；

将待检猪干扰素α样品加入克隆化培养后的细胞中，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价待检猪干扰素α样品的效价。

2.根据权利要求1所述的荧光素酶报告基因法猪干扰素α生物学活性检测方法，其特征在于：

pMx1的基因片段序列为序列1所示；

pMx1-luc融合基因片段序列为序列2所示。

3.根据权利要求1所述的荧光素酶报告基因法猪干扰素α生物学活性检测方法，其特征在于，采用PCR扩增获取猪Mx1蛋白的pMx1的基因片段的步骤包括：

根据Genebank中已公布的猪Mx1蛋白的基因序列，选择5'端含有ISRE反应元件的启动子区域，设计PCR引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；

将扩增产物进行双酶切，再通过切胶回收纯化获得pMx1的基因片段；

优选的，采用PCR扩增获取猪Mx1蛋白的pMx1的基因片段将扩增产物进行双酶切的步骤中选用的酶为KpnI和HindIII。

4.根据权利要求1所述的荧光素酶报告基因法猪干扰素α生物学活性检测方法，其特征在于，将PCR扩增获得的猪Mx1蛋白的pMx1的基因片段插入pGL3-basic载体luc基因的5'端，再采用PCR扩增得到pMx1-luc融合基因片段的步骤包括：

通过T4DNA连接酶将pMx1的基因片段连入pGL3-Basic质粒luc基因的5'端；

转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，摇菌，筛选出阳性克隆后提取重组pGL3-basic质粒，通过DNA测序获得重组pGL3-basic质粒的pMx1片段的DNA序列，选择含正确序列的重组pGL3-basic质粒；

以含正确序列的重组pGL3-basic质粒的DNA序列为模板，设计PCR引物，进行PCR扩增，得到产物；

将产物进行双酶切，再通过切胶回收纯化获得pMx1-luc融合基因片段；

优选的，将PCR扩增获得的猪Mx1蛋白的pMx1的基因片段插入pGL3-basic载体luc基因的5'端，再采用PCR扩增得到pMx1-luc融合基因片段将产物进行双酶切的步骤中选用的酶为Ase I和Xba I；

优选的，用pMx1-luc融合基因片段替代pEGFP-N1载体中的pCMV和EGFP的基因片段，构建pMx1-luc质粒的步骤包括：

去除pEGFP-N1载体质粒中的pCMV和EGFP的基因片段；

通过T4DNA连接酶用pMx1-luc融合基因片段替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV和EGFP的基因片段，构建pMx1-luc质粒；

转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，摇菌，提取质粒，通过DNA测序获得质粒pMx1-luc融合基因片段的DNA序列，选择正确序列的质粒；

所述正确序列为：pMx1的基因片段序列为序列1所示，pMx1-luc融合基因片段序列为序列2所示。

5.根据权利要求1所述的荧光素酶报告基因法猪干扰素α生物学活性检测方法，其特征在于，用pMx1-luc质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株的步骤包括：

通过转染试剂将pMx1-luc质粒转染至细胞，转染96h后，换成含2μg/mL新霉素的完全培养基持续培养14日，筛选出具有新霉素抗性的细胞，即为稳定转染细胞株。