[发明专利]荧光素酶报告基因法猪干扰素α生物学活性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光素酶报告基因法猪干扰素α生物学活性检测方法，属于干扰素活性检测技术领域。

背景技术

干扰素α广泛应用于抗病毒感染和免疫功能障碍方面的疾病治疗，其作为一种细胞因子通过与靶细胞表明的特定受体结合引起细胞内系列信号转导途径的激活，表现出抗病毒作用或免疫调节作用。目前干扰素α在细胞内起作用的信号转导途径已经研究的比较透彻，主要是通过激活JAK-STAT信号级联来实现的。干扰素α与受体结合激活受体相关JAK1和TYK2，使STAT1和STAT2络氨酸磷酸化，磷酸化的STAT1和STAT2形成二聚体并转移入核，装配干扰素调节因子9(IRF9)形成3聚体的干扰素刺激因子3(ISGF3)。ISGF3与其同源DNA序列(干扰素刺激反应原件，ISREs)结合，直接激活干扰素刺激基因(ISGs)转录，使宿主细胞进入抗病毒状态。ISG抑制病毒的途径主要有，抑制病毒的转录、翻译和核酸复制；降解病毒核酸；改变宿主细胞脂代谢。因此，只要检测到ISGs的启动子活性增加就可以直接反应干扰素α的生物学活性。

Mx蛋白(Mx prorein)是主要的ISGs，干扰素α可以经JAK-STAT信号转导途径激活Mx启动子(Mx promoter，pMx)，促进Mx的表达，Mx能够抑制负链RNA病毒复制。在猪中存在Mx1和Mx2两种蛋白，其中Mx1起主要作用。pMx有较好的专一性，它不能被白细胞介素(Interleukin)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)等其它细胞因子启动。

目前检测干扰素生物学活性主要有3种方法，病毒复制抑制、噬斑减少分析和细胞病变抑制。但这3种方法都容易产生较大误差，重复性不好，精确度低。作为改进，随后用表达GFP的重组VSV病毒替代野生型VSV病毒，可以通过荧光蛋白的表达来反映病毒感染复制的数量程度，进而判定IFN对病毒复制的抑制程度，敏感性和重复性显著改善，但仍然存在检测过程耗时过长、不便于大通量样品检测、敏感性不够理想及活病毒生物安全隐患等诸多不足。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种利用荧光素酶报告基因(luc)检测猪干扰素α生物学活性的方法，能够简化检测过程，不需要重复进行病毒培养或质粒转染的繁琐操作，提高准确性和重复性，避免了可能存在的生物安全危害。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

一种荧光素酶报告基因法猪干扰素α生物学活性检测方法，其包括以下步骤：

采用PCR扩增获取猪Mx1蛋白的pMx1的基因片段；

将PCR扩增获得的猪Mx1蛋白的pMx1的基因片段插入pGL3-basic载体luc基因的5'端，再采用PCR扩增得到pMx1-luc融合基因片段；

用pMx1-luc融合基因片段替代pEGFP-N1载体中的pCMV和EGFP的基因片段，构建pMx1-luc质粒；

用pMx1-luc质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株；

对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养；

以梯度稀释的猪干扰素α标准品制备标准曲线，确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系；

将待检猪干扰素α样品加入克隆化培养后的细胞中，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价待检猪干扰素α样品的效价。

上述的荧光素酶报告基因法猪干扰素α生物学活性检测方法中，将待检猪干扰素α样品加入克隆化培养后的细胞中，需要孵育一定的时间，一般6小时左右。

本发明中，pMx1是指猪Mx1基因启动子区域，pCMV是指pEGFP-N1质粒的CMV启动子区域。

上述的荧光素酶报告基因法猪干扰素α生物学活性检测方法中，优选的：

pMx1的基因片段序列为序列1所示；

pMx1-luc融合基因片段序列为序列2所示。

上述的荧光素酶报告基因法猪干扰素α生物学活性检测方法中，优选的，采用PCR扩增获取猪Mx1蛋白的pMx1的基因片段的步骤包括：

根据Genebank中已公布的猪Mx1蛋白的基因序列，选择5'端含有ISRE反应元件的启动子区域，设计PCR引物，进行PCR扩增，得到扩增产物pMx1基因片段；

将扩增产物进行双酶切，再通过切胶回收纯化获得pMx1的基因片段。

上述的荧光素酶报告基因法猪干扰素α生物学活性检测方法中，优选的，采用PCR扩增获取猪Mx1蛋白的pMx1的基因片段将扩增产物进行双酶切的步骤中选用的酶为KpnI和HindIII。