[发明专利]一种MTRR的SNP位点的快速扩增检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种MTRR的SNP位点的快速扩增检测试剂盒和检测方法，其中所述试剂盒由高效扩增组和焦磷酸测序组组成，其中高效扩增组用于MTRR A66G的SNP位点的线性指数PCR扩增，扩增产物经焦磷酸测序组测序，扩增引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，退火引物序列如序列表SEQ ID NO：4所示。本发明采用线性指数扩增的目标片段扩增方法，精准设计的扩增引物扩增效率高且错配少，不仅大大增加了扩增效率，且直接扩增出单链DNA可直接用于焦磷酸测序，无需对扩增产物进行标记和双链分离，避免了繁冗的实验步骤，也减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤。

技术领域

本发明涉及一种MTRR的SNP位点的快速扩增检测试剂盒及检测方法，属于生物技术领域，尤其是生物样品检测领域。

背景技术

甲硫氨酸合成酶还原酶MTRR(5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferase reductase)，全称为编码5-甲基四氢叶酸-同型半胱氨酸甲基转移酶还原酶。甲硫氨酸是蛋白质合成和一碳代谢的必需氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合成酶(MTR基因编码)催化的，而甲硫氨酸合成酶因为辅助因子维生素B12被氧化而最终失活。MTRR编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化(reductive methylation)作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合成酶。MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症E型的主要病因，也是同型半胱氨酸、叶酸代谢异常的主要原因之一。而同型半胱氨酸、叶酸代谢与许多疾病(唐氏综合征、神经管疾病、心血管疾病等)相关，因此MTRR被认为是这些疾病的风险因素之一。

由于叶酸缺乏对于孕妇及胎儿的影响较大，因此MTRR一直与MTHFR一起检测，但由于现阶段临床检测中MTHFR具有多个单核苷酸多态性(SNP)位点，而MTRR主要的SNP位点只有一个，因此将MTRR与MTHFR一起进行检测无形中增加了对MTRR的检测成本。且MTRR的SNP位点不仅在孕检中会被检测，MTRR的基因多态性还会影响到含硫氨基酸的代谢过程，DNA甲基化，蛋氨酸代谢过程中，蛋氨酸的生物合成过程中，甲基化，S-腺苷甲硫氨酸循环，氧化还原过程和胱硫醚-β-合成酶活性的负调控等生物过程，因此还在很多诊断中需要单独进行检测，因此，需要研发一种快速检测MTRR的SNP位点的快速扩增检测方法。

MTRR全长32,021kb，共有15个外显子，位于人类染色体5号的5p15.3-p15.2位置，其最主要的SNP位点为A66G，常用的检测方法是扩增后测序或基因芯片测序，但这些检测方法检测时间长、步骤繁琐，需要的样本量大且检测成本高，大大增加了被测者的经济负担，长时间的结果等待对孕妇及病患心理也具有一定影响，因此，发明人基于对焦磷酸测序的多年研究，开发出了一款基于焦磷酸测序的MTRR的SNP位点的快速扩增检测试剂盒和检测方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以焦磷酸测序为基础，获得一种MTRR的SNP位点的快速扩增检测试剂盒和检测方法。

为实现上述发明目的之一，本发明采用的MTRR的SNP位点的快速扩增检测试剂盒的技术方案如下：

试剂盒由高效扩增组和焦磷酸测序组组成，其中高效扩增组用于MTRR A66G的SNP位点的线性指数PCR扩增，MTRR A66G的基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示，所述试剂盒由高效扩增组和焦磷酸测序组组成，其中高效扩增组包括：扩增引物、DNA聚合酶、扩增缓冲液、dNTPs和Mg²⁺，高效扩增组用于MTRR A66G的SNP位点的线性指数PCR扩增；扩增产物退火后经焦磷酸测序组测序，焦磷酸检测组包括：退火引物、DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、dNTP，以及Klenow酶。

优选的，扩增引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，退火引物序列如序列表SEQ ID NO：4所示。