[发明专利]一种慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述慢病毒载体包括基因元件组成的基因片段，所述基因元件按以下顺序顺次连接：TMEM119启动子、iCre基因、Cx3cr1启动子、loxP位点、DsRed基因和EGFP基因。本发明的慢病毒可以特异性活体标记小胶质细胞，准确地实时区分小胶质细胞与其他细胞，在研究小胶质细胞的发育、行为和功能等方面具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，尤其涉及一种特异性活体标记小胶质细胞的慢病毒及其制备方法和应用。

背景技术

小胶质细胞(microglia)是中枢神经系统最小的神经胶质细胞，分布于整个中枢神经系统，约占胶质细胞总数的5％-10％。作为常驻中枢神经系统的免疫效应细胞，小胶质细胞隶属于单核吞噬细胞族，被认为是中枢神经系统的主要免疫效应器。小胶质细胞及其介导的神经炎症在中枢神经系统的损伤及疾病的转归过程中起着非常重要的作用，参与诸如HIV脑病、帕金森病、阿尔兹海默病和多发性硬化等人神经系统紊乱疾病。

Cre重组酶是一种来源于P1噬菌体的位点特异性络氨酸重组酶，属于λ整合酶超家族，由一个五价物[Arg-Lys-(His/Lys)-Arg-(His/Trp)]协助催化DNA重组过程中DNA链的断裂和重连，cre插入内含子后形成icre。loxP位点是一段总长度为34bp的反向重复DNA序列，Cre重组酶介导两个loxP位点之间的重组，而且，两个loxP位点的方向和位置可以造成重组后的三种结果：删除、翻转或整合。由于Cre-loxP系统不需要任何辅助因子，经逐步改造后被广泛应用于真核细胞，目前已经在细胞发育追踪、基因敲除、基因条件表达等领域发挥了显著作用。

GFP是一种来源于Aequorea victoria水母的蛋白质，可在蓝色波长光线的激发下发出绿色荧光，EGFP是GFP的突变系，在488nm光源激发下，其发光强度是GFP的35倍。DsRed是一种来源于Discosomasp珊瑚虫、与GFP同源的红色荧光蛋白，可在绿色波长光线的激发下发出红色荧光。

跨膜蛋白119(Tmem119)是一种细胞表面跨膜蛋白，可作为人或小鼠的小胶质细胞特异性高表达标志物。Cx3c趋化因子受体1(Cx3cr1)是一种位于细胞表面的受体蛋白，存在于NK细胞、单核细胞、T细胞等免疫细胞表面。

目前，区分或标记小胶质细胞的主要方法包括形态学观察、特征性蛋白免疫组织化学染色和单启动子荧光蛋白标记，然而这些方法特异性较差，无法准确地区分小胶质细胞与中枢神经系统的其他细胞，且标记过程中需要处死小鼠，无法在活体状态下进行特异性标记。

在现有的特异性标记小胶质细胞的技术中，Tmem119标志物免疫组织化学染色法(M.L.Bennett et al.New tools for studying microglia in the mouse and humanCNS.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A,113,E1738-E1746(2016))使用Tmem119抗体(Tmem119-antibody)特异性结合小胶质细胞表面的Tmem119蛋白，实现了在体外针对小胶质细胞的特异性标记。然而，该方法需要处死小鼠后完成取脑、固定脱水、冰冻切片和免疫组织化学染色的复杂操作，无法实现活体标记、检测和追踪。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种慢病毒系统及其制备方法和应用，所述慢病毒可以特异性活体标记小胶质细胞，准确地实时区分小胶质细胞与其他细胞，在研究小胶质细胞的发育、行为和功能等方面具有重要意义。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包括基因元件组成的基因片段，所述基因元件按以下顺序顺次连接：TMEM119启动子、iCre基因、Cx3cr1启动子、loxP位点、DsRed基因和EGFP基因。