[发明专利]一种厚垣孢普可尼亚菌固体发酵产孢的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种厚垣孢普可尼亚菌固体发酵产孢的方法，属于微生物发酵领域。

背景技术

植物寄生线虫病害属于土传病害，主要采用传统化学药剂防治。厚垣孢普可尼亚菌是一种兼性寄生菌，既能寄生线虫又能在土壤中营腐生生活，广泛分布于世界各地的土壤中，其显著的特征是能形成厚壁的、砖格状的厚垣孢子，厚垣孢子对高温、干旱的耐受力强，易在极端环境下存活，具有其他线虫生防菌所没有的优势，有较大的生防潜力。

生防制剂的生产工艺主要包括菌株选育、发酵工艺和剂型研制等要素，高效、稳定的菌株是实现生防菌应用的前提，发酵工艺是生防菌大规模生产的关键。厚垣孢普可尼亚菌能在多种液体和固体基质中生长和繁殖，但在液体培养时难以产生厚垣孢子。而固体发酵能产生与自然接种体相似的气生分生孢子或厚垣孢子，且产生的孢子在常温下比液体发酵产生的孢子稳定。目前生防菌剂大规模工业化生产应用得较多的是液固双相发酵工艺，该工艺最大的特点是液体和固体培养基的配制，并且充分利用了液体发酵和固体发酵的优点，利用液体发酵快速生产大量的菌丝或孢子作为固体发酵的接种体，然后在固体基质上产生接近自然侵染体形态的气生分生孢子或厚垣孢子。

国内外研究表明厚垣孢普可尼亚菌能在麦麸、小麦、小麦杆、大麦谷粒及粗沙混合组成的培养基上生长并产生厚垣孢子；以胡萝卜块、大米粒、玉米粒、马铃薯块、小麦粒、高粱粒、麦秆、稻秆为固体培养基质培养厚垣孢普可尼亚菌，在马铃薯块上厚垣孢子产量最大，为18.75×10⁴ 个/mL，而稻秆上不产生厚垣孢子，在大米粒和高粱粒上长势最好。以高粱粒为原料大批量培养厚垣孢普可尼亚菌，以鸡粪为载体，添加适量微量元素、金属离子、氮肥制成的“豆丰”一号颗粒剂对大豆胞囊线虫有较好的持续防治效果。虽然在麦麸、小麦、玉米粒、草炭等固体培养基上都能培养厚垣孢普可尼亚菌，但没有形成大规模的发酵生产技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够使厚垣孢普可尼亚菌产生大量孢子的液体和固体培养基以及固体发酵方法。

本发明所述的方法包括以下步骤：厚垣孢普可尼亚菌菌种活化、发酵液的制备以及固体发酵产孢。

步骤一，厚垣孢普可尼亚菌菌种活化：将厚垣孢普可尼亚菌菌种接种在PSA斜面培养基上活化，28℃黑暗培养5天。

步骤二，发酵液的制备：斜面菌种活化后，接种到PSA平板上，28℃黑暗培养5天，用打孔器从平板上菌落边缘打取菌碟（φ=10mm）作为接种体，按每100mL培养液接入5个菌碟，培养液为3wt.%虾壳粉培养液，28℃、150r/min摇床振荡培养48~72h，即得种子液。将种子液按10%的接种量接种至3wt.%虾壳粉培养液中，28℃、150r/min摇床振荡培养48~72h，即得发酵液。

步骤三，固体发酵产孢：固体发酵产孢所使用的培养基配方为： 20~50目玉米粉60%~76%，菌草20%~36%，蔗糖1.0%~5.0%，硝酸钠1.0%~5.0%，氯化钠 1.0%~5.0%，pH自然。

优选的，固体发酵产孢所使用的培养基配方为：30~50目玉米粉65%~75%，菌草按20%~30%的比例混合，蔗糖0.75%~3.0%，硝酸钠0.85%~3.4%，氯化钠 1.0%~3.0%，pH自然。

更为优选的，固体发酵产孢所使用的培养基配方为：30目玉米粉67.65%，菌草29.0%，蔗糖1.5%，硝酸钠0.85% ，氯化钠 1.0% ，pH自然。

固体发酵产孢的方法为组培瓶发酵或浅盘发酵。

组培瓶发酵：30目玉米粉67.65%，菌草29.0%，蔗糖1.5%，硝酸钠0.85%，氯化钠1.0%，pH自然，加入水拌匀，含水量为50%，分装于组培瓶中。每瓶装10g培养基，用纱布封口，121℃间歇湿热灭菌30min，降温后以48~60h的发酵液作为固体发酵的接种体，接种量为0.50 ~1.50mL/g。置于28℃培养箱中静置培养7天。

浅盘发酵：30目玉米粉67.65%，菌草29.0%，蔗糖1.5%，硝酸钠0.85% ，氯化钠 1.0% ，pH自然，加入水拌匀，含水量为50%，用聚乙烯袋装好后，121℃间歇湿热灭菌30min。冷却后，以48~60h的发酵液作为固体发酵的接种体，接种量为0.50 ~1.50mL/g，将接种后的培养料平铺于浅盘上，厚度约3~5cm，将浅盘置于28℃、湿度为80%以上的条件下，培养10天。

优选的，固体发酵方法中，以48h的发酵液作为固态发酵的接种体，接种量为0.50mL/g。