[发明专利]一种CAV-1基因缺失斑马鱼及其制备方法在审
| 申请号： | 201711273893.7 | 申请日： | 2017-12-06 |
| 公开（公告）号： | CN108148873A | 公开（公告）日： | 2018-06-12 |
| 发明（设计）人： | 吕志平;高磊;刘强;黄鹏;林海燕;周振婷;周楚莹 | 申请（专利权）人： | 南方医科大学 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12Q1/6888;A01K67/027 |
| 代理公司： | 广州新诺专利商标事务所有限公司 44100 | 代理人： | 周端仪 |
| 地址： | 510515 广东省广州*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因缺失 斑马鱼 突变体 制备 突变体模型 技术实现 肿瘤发生 构建 可用 远端 基因 研究 | ||
1.一种CAV-1基因敲除方法，其特征在于，设计识别CAV-1基因靶位点的sgRNA序列，所述的sgRNA序列与核酸酶结合并引导核酸酶结合到CAV-1基因靶位点处，核酸酶对靶位点处的序列进行随机剪切，通过细胞自身的非同源末端连接修复机制修复CAV-1基因双链，造成移码突变，完成CAV-1基因被敲除。
2.根据权利要求1所述的CAV-1基因敲除方法，其特征在于，所述的sgRNA序列具有序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述的核酸酶为Cas9蛋白。
3.根据权利要求2所述的CAV-1基因敲除方法，其特征在于，所述的SEQ ID NO:1记载的核苷酸序列含有HaeⅡ酶切位点；所述的SEQ ID NO:2记载的核苷酸序列含有StyⅠ酶切位点。
4.一种CAV-1基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
1)设计并合成识别CAV-1基因靶位点的sgRNA序列，所述的sgRNA序列具有序列表中SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
2)将所述的sgRNA序列和Cas9mRNA共同显微注射到斑马鱼胚胎中，然后对得到的斑马鱼胚胎进行培养，得到所述的CAV-1基因缺失斑马鱼突变体。
5.根据权利要求4所述的CAV-1基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：查询斑马鱼CAV-1基因序列及功能结构域，结合CRISPR/Cas9敲除原理，设计并合成包含sgRNA序列的引物序列，然后通过PCR扩增得到大量双链sgRNA序列，接着通过体外转录双链sgRNA序列得到单链sgRNA序列。
6.根据权利要求5所述的CAV-1基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，所述的引物序列具有序列表中SEQ ID NO:3或者SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，以及具有序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求4所述的CAV-1基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的Cas9mRNA来自于pGH-T7-zCas9质粒，XbaⅠ酶切pGH-T7-zCas9质粒得到Cas9DNA双链，然后通过体外转录Cas9DNA双链得到Cas9mRNA单链。
8.根据权利要求4所述的CAV-1基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的斑马鱼胚胎为单细胞期胚胎，显微注射剂量为2nL；其中，sgRNA的注射浓度为300ng/μL，Cas9mRNA的注射浓度为120ng/μL。
9.一种CAV-1基因缺失斑马鱼突变体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以待检测的斑马鱼基因组DNA为模板，PCR扩增含有权利要求2中所述的sgRNA序列的DNA片段，然后HaeⅡ或者StyⅠ酶切该DNA片段，实现CAV-1基因缺失斑马鱼突变体的检测。
10.根据权利要求9所述的CAV-1基因缺失斑马鱼突变体的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的引物序列具有序列表中SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，或者具有序列表中SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
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