[发明专利]一种CAV-1基因缺失斑马鱼及其制备方法

说明书

本发明提供一种CAV‑1基因缺失斑马鱼突变体及其制备方法，CAV‑1基因缺失斑马鱼突变体的构建是通过CRISPR/Cas9技术实现的。本发明的突变体模型可用于研究CAV‑1基因在肿瘤发生和远端转移过程中的作用。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，涉及一种基因敲除的斑马鱼突变体，具体涉及CAV-1基因缺失斑马鱼突变体及其制备方法。

背景技术

成簇规律间隔回文重复序列CRISPR(Clustered Regularly Interspaced ShortPalind-romic Repeats)和CRISPR相关核酸酶Cas(CRISPR-associated nuclease)系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制。该系统能够识别自身序列和外源入侵DNA 片段，并剪切掉外源片段，从而达到保护自己的目的。科学家将这种免疫机制开发成为一种基因定点编辑技术，广泛应用于生物学和医学研究，目前最常见的基因编辑技术为 CRISPR/Cas9系统。该系统通过向导RNA(single guide RNA,sgRNA)序列，一方面特异识别靶序列，另一方面引导Cas9蛋白定点切割靶位点，使DNA靶位点形成双链缺口，细胞通过同源重组修复或者非同源性末端连接对断裂的DNA进行修复，从而实现基因的编辑。

Caveolae结构细胞质膜向内凹陷所形成的囊泡状结构，参与细胞内外物质转运和细胞信号传导过程。微囊蛋白-1(Caveolin-1)是Caveolae结构的主要成分，对许多关键信号分子的活性状态起直接调节作用。有研究表明，Caveolin-1与肿瘤的发生与远处转移、癌细胞的转化等过程相关。CAV-1基因是编码Caveolin-1蛋白的DNA序列，可以通过对CAV-1基因进行定点编辑，从而研究Caveolin-1蛋白在肿瘤中的具体作用，以实现治疗疾病的目的。

斑马鱼具有生长发育快，繁殖周期短、子代数量多、体外受精、胚胎透明等生物学特性，十分适合进行基因编辑。构建CAV-1基因突变斑马鱼作为疾病模型，能深入探究CAV-1基因与相关疾病的联系及发生机制，为靶向药物的筛选提供一种稳定可靠的模式生物。

发明内容

基于此，本发明的目的在于，提供一种CAV-1基因缺失斑马鱼及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种CAV-1基因敲除方法，其过程包括，设计识别CAV-1基因靶位点的sgRNA序列，所述的sgRNA序列与核酸酶结合并引导核酸酶结合到CAV-1基因靶位点处，核酸酶对靶位点处的序列进行随机剪切，通过细胞自身的非同源末端连接修复机制修复CAV-1基因双链，造成移码突变，完成CAV-1基因被敲除。

进一步地，所述的sgRNA序列具有序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述的核酸酶为Cas9蛋白。

进一步地，所述的SEQ ID NO:1记载的核苷酸序列含有HaeⅡ酶切位点；所述的SEQID NO:2记载的核苷酸序列含有StyⅠ酶切位点。

本发明所述的CAV-1基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，包括以下步骤：

1)设计识别CAV-1基因靶位点的sgRNA序列，所述的sgRNA序列具有序列表中SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

2)将所述的sgRNA序列和Cas9mRNA共同显微注射到斑马鱼胚胎中，然后对得到的斑马鱼胚胎进行培养，得到所述的CAV-1基因缺失斑马鱼突变体。

进一步地，所述步骤1)具体包括：查询斑马鱼CAV-1基因序列及功能结构域，结合CRISPR/Cas9敲除原理，设计并合成包含sgRNA序列的引物序列，然后通过PCR扩增得到大量双链sgRNA序列，接着通过体外转录双链sgRNA序列得到单链sgRNA序列。