[发明专利]具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质的制备方法

说明书

本案涉及一种具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质的制备方法，包括层析基质和配基，所述层析基质经一缩二乙二醇双缩水甘油醚活化后依次偶联3‑吡咯羧酸和4‑氨基‑2‑羰基嘧啶形成双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质。本发明以3‑吡咯羧酸和4‑氨基‑2‑羰基嘧啶为双功能配基制备新型的疏水性电荷诱导层析介质，引入双功能基团的概念，优化配基的空间排布，提高抗体结合的选择性，因此具有独特的分离性能。

技术领域

本发明涉及一种具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质的制备方法，属于生物化工领域中的蛋白层析分离技术。

背景技术

抗体(antibody)是生物体内最重要的免疫物质之一，参与了机体的免疫过程反应。由于抗体和抗原具有高度的亲和性和特异性，被广泛应用于临床医疗领域。单克隆抗体(简称单抗，monoclonal antibody，mAb)作为一类重要的抗体药物，具有特异性强，亲和力高，毒副作用低等优点，用于癌症等重大疾病治疗和免疫诊断等。分离纯化是抗体生产制备的重要环节，下游过程约占抗体药物生产成本的80％，因此开发高效、低成本的抗体纯化新机制和新方法具有重要的意义。

层析是目前抗体分离的主要方法，包括亲和层析、离子交换层析、疏水相互作用层析以及混合模式层析等。Protein A亲和层析是典型代表，选择性好，分辨率高，一步分离即可获得较高纯度的抗体产品，但也存在一些局限，例如成本较高，处理量有限，洗脱pH较低，在线清洗困难等。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本案提供一种具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质的制备方法。

为实现上述目的，本案通过以下技术方案实现：

具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质的制备方法，

所述层析介质包括层析基质和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，所述的配基为3-吡咯羧酸的羧基和4-氨基-2-羰基嘧啶的氨基反应后形成的双功能配基；

所述层析基质为经粗化处理的二氧化硅微球；

所述层析基质经一缩二乙二醇双缩水甘油醚活化后依次偶联3-吡咯羧酸和4-氨基-2-羰基嘧啶形成双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质；具体包括如下步骤：

1)将层析基质抽干后，加入0.5-1.5倍层析基质质量的20％v/v二氧六环、0.3-1.6倍层析基质质量的一缩二乙二醇双缩水甘油醚和0.3-0.7倍层析基质质量的氢氧化钠，40℃搅拌反应10-20小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；

2)将活化层析基质和0.1-0.5倍层析基质质量的3-吡咯羧酸以及0.1-0.5倍层析基质质量的氢氧化钠溶液混合，在50℃下搅拌反应8-16小时，得到3-吡咯羧酸偶联的介质；

3)取3-吡咯羧酸偶联的介质，分别用体积百分比为30％、70％和100％的乙醇溶液清洗，再用二甲基甲酰胺清洗，加入0 .6-1.5倍层析基质质量的二甲基甲酰胺、2-氨基-1,3,5-三嗪和N,N-二环己基碳酰亚胺，50℃振荡10-20小时，得到2-氨基-1,3,5-三嗪活化的介质；

4)取2-氨基-1,3,5-三嗪活化的介质，依次用体积百分比为60％和40％的丁酮溶液清洗，去离子水洗涤，加入2-5倍层析基质质量的10mg/ml4-氨基-2-羰基嘧啶溶液，30℃下200rpm水浴摇床中反应12-36小时；最后将介质抽滤，去离子水洗涤，得到具有3-吡咯羧酸和4-氨基-2-羰基嘧啶双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质。

优选的是，所述层析介质配基密度为50-150mol/ml。

优选的是，所述2-氨基-1,3,5-三嗪浓度为0.1-0.5g/ml，N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.6-1g/ml。

本发明的有益效果是：