[发明专利]一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法

权利要求书

1.一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法，包括：

(1)将培养好的香菇菌丝体过滤，在液氮中速冻；然后研磨成粉，加入-20℃预冷的TCA/丙酮溶液涡旋，-20℃静置过夜沉淀蛋白，离心弃上清；再加入-20℃预冷的丙酮溶液涡旋，-20℃静置1～2h，离心弃上清，冷冻干燥，得到香菇菌丝体总蛋白；

(2)取香菇菌丝体总蛋白，加入蛋白质裂解液溶解，震荡、离心，取上清，得到蛋白样品；定量蛋白样品，然后在胶条上进行等电聚焦；取出胶条，进行平衡，将处理完成的胶条转移至凝胶顶端，用琼脂糖封胶液封顶，进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；最后将所得到的凝胶洗涤固定、考马斯亮蓝染色液染色，得到双向电泳图谱。

2.根据权利要求1所述的一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法，其特征在于：所述步骤(1)中的香菇菌丝体先用灭菌的无纺布过滤菌丝，再用吸水纸吸干菌丝的水分。

3.根据权利要求1所述的一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法，其特征在于：所述步骤(1)中的TCA/丙酮溶液和丙酮溶液均含有0.1％二硫基苏糖醇。

4.根据权利要求1所述的一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法，其特征在于：所述步骤(2)中的蛋白质裂解液的组分为：2mol/L硫脲、2％的CHAPS、7mol/LUrea、2％的IPG-Buffer、65mmol/L DTT、蛋白酶抑制剂。

5.根据权利要求1所述的一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法，其特征在于：所述步骤(2)中的等电聚焦的上样量为500μg。

6.根据权利要求1所述的一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法，其特征在于：所述步骤(2)中的平衡具体为：向水化盘中加入5mL平衡液Ⅰ，摇动15min，倒掉平衡液Ⅰ，加入平衡液Ⅱ，摇动15min。

7.根据权利要求6所述的一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法，其特征在于：平衡储备液的组分为50mmol/L pH 8.8Tris-HCl，6mol/L Urea，30％Glycerol，2％SDS，0.002％Bromphenol blue；所述平衡液Ⅰ为平衡储备液外加DTT，所述平衡液Ⅱ为平衡储备液外加碘乙酰胺。

8.根据权利要求1所述的一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法，其特征在于：所述步骤(2)中所使用的凝胶浓度为12.5％。

9.根据权利要求1所述的一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法，其特征在于：所述步骤(2)中的固定采用40％甲醇和10％乙酸固定。

10.根据权利要求1所述的一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法，其特征在于：所述步骤(2)中的考马斯亮蓝染色液的组分为：8％硫酸铵、0.8％磷酸、0.08％考马斯亮蓝、20％甲醇。