[发明专利]一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法

说明书

本发明涉及一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法，包括采用TCA/丙酮法提取，再对TCA/丙酮法提取的总蛋白质进行上样量及凝胶浓度进行优化。本发明得到的双向电泳图谱分离效果较好，蛋白质点的数目明显增加，呈现圆形或者椭圆形，横向和纵向条纹较少，分布均匀并且没有拖尾现象，为研究香菇菌丝体蛋白组学提供技术支持，同时，也为大型食用真菌菌丝体蛋白质组学研究提供理论依据。

技术领域

本发明属于香菇菌丝体蛋白研究领域，特别涉及一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法。

背景技术

香菇(Lentinula edodes)属于担子菌门、层菌纲、伞菌目、口蘑科、香菇属，是重要的食药用真菌，又名花菇、香蕈、香信、香菌、冬菇等，是世界第二大食用菌。香菇营养丰富、味道鲜美，具有药用价值，香菇多糖能降低胆固醇并提高机体的免疫力，具有抑制癌细胞生长的作用。我国也是目前世界上最大的香菇生产、出口和消费国。

随着人类基因组序列草案的发表，部分生物的全基因组测序也随之完成，尤其是随着拟南芥等模式生物基因组和转录组序列的测定和深入研究，研究人员已经意识到单从基因角度无法深入地了解生物体的机能。因此，就需要研究基因的最终产物蛋白质。

双向凝胶电泳技术是应用最为广泛的蛋白质组分离技术，O’Farrell(1975)率先提出双向凝胶电泳技术，其原理是在相互垂直的两个方向上，分别基于不同蛋白质的等电点和分子量不同，运用等电聚焦电泳(IEF)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳把复杂的蛋白质成分分离。这种方法可以对上千种蛋白进行分离，并且可以同时比较蛋白表达量的差异；根据不同蛋白质等电点及分子质量不同，对理化性质不同的蛋白质进行有效地分离；并可区别磷酸化和非磷酸化的蛋白或某些经过加工修饰的蛋白。双向凝胶电泳具有简单、快速、高分辨率和重复性，并能够直观分析蛋白质的等电点、相对分子质量、表达丰度相对量和表达差异等方面的信息，是应用最为广泛的蛋白分离技术。

但是，截至目前为止，还没有一种双向电泳方法适用于所有的食用菌的各个组织，因此，需要在已被开发的诸多提取方法中根据所提取组织的特性对下游操作进行选取和优化。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法，该方法解决了现有大型食用真菌菌丝体双向电泳图像不清晰、横条纹多、蛋白点分离效果差的问题，为研究大型食用真菌菌丝体蛋白质组学提供技术支持。

本发明提供了一种用于双向电泳的香菇菌丝体总蛋白提取和分离方法，包括：

(1)将培养好的香菇菌丝体过滤，在液氮中速冻；然后研磨成粉，加入-20℃预冷的TCA/丙酮溶液涡旋，-20℃静置过夜沉淀蛋白，离心弃上清；再加入-20℃预冷的丙酮溶液涡旋，-20℃静置1～2h，离心弃上清，冷冻干燥，得到香菇菌丝体总蛋白；

(2)取香菇菌丝体总蛋白，加入蛋白质裂解液溶解，震荡、离心，取上清，得到蛋白样品；定量蛋白样品，然后在胶条上进行等电聚焦；取出胶条，进行平衡，将处理完成的胶条转移至凝胶顶端，用琼脂糖封胶液封顶，进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；最后将所得到的凝胶洗涤固定、考马斯亮蓝染色液染色，得到双向电泳图谱。

所述步骤(1)中的香菇菌丝体先用灭菌的无纺布过滤菌丝，再用吸水纸吸干菌丝的水分。

所述步骤(1)中的TCA/丙酮溶液和丙酮溶液均含有0.1％二硫基苏糖醇(DDT)。

所述步骤(1)中丙酮洗涤操作重复进行三次。

所述步骤(2)中的蛋白质裂解液的组分为：2mol/L硫脲、2％的CHAPS、7mol/LUrea、2％的IPG-Buffer、65mmol/L DTT、蛋白酶抑制剂(在临用前加入)。总蛋白与蛋白质裂解液的质量体积比为35mg:1mL。震荡时间为2-4h。