[发明专利]桑花叶型萎缩病相关病毒检测引物和质粒及检测方法

说明书

本发明公开了一种桑花叶型萎缩病相关病毒检测引物和质粒及检测方法。所述引物包括上游引物MCP746f和下游引物MCP1148r，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，同时构建了用于检测的阳性质粒，以上游引物13MCP156f和下游引物13MCP1464r扩增获得1309bp大小的片段构建质粒13MCP‑pEASY‑Bblunt，质粒及引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。基于本发明检测引物可特异地检测桑花叶型萎缩病相关病毒，检测结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高。尤其是对于处于侵染早期（潜育期）的病叶的检测，具有重要的实际应用意义，同时其可对病株的叶、叶柄、芽、枝上存在的病原菌进行检测，对桑花叶型萎缩病相关病毒的防控有切实的指导意义。

技术领域

本发明涉及病原分子检测技术领域。更具体地，涉及一种在桑花叶型萎缩病相关病毒分子检测中的应用。

背景技术

桑树作为我国重要经济作物，随着桑树资源的综合利用，桑树除作为蚕主要的食物外，其食药用价值、生态修复功能更多的被需求。随着桑产业的壮大，桑树病害将逐渐成为我们关注的焦点。

桑花叶型萎缩病作为最重要的桑树病毒病之一，在我国各蚕区发生较普遍且危害严重。该病对桑叶的产量影响非常大，杂交桑品种的推广导致抗病品种种植面积减少，最终导致该病的发生面积大大增加(邱长玉等,2011)。

桑花叶型萎缩病的症状主要是叶片边缘稍向叶面卷起，成皱缩状，叶片缺刻加深，叶背脉有时会呈现棘状突起，侧脉间叶肉褪色，呈现斑驳或花叶症状(张月季,1983)。发病初期，叶片侧脉间因褪绿出现黄绿色或淡绿色斑块。随着病情发展，叶缘稍向叶面卷起，叶背脉有瘤状突起。后期，病叶卷缩成空心，叶脉部满瘤状突起且明显变褐，病株逐渐衰亡。由于气温的变化，在同一枝条上的叶片有间歇出现病症的现象，当气温高达30℃时，病症隐蔽。花叶症状在气温较低时出现，簇生症状在气温较高时出现(王太兴,2009；张月季和林玉松,1964)。

2010年白锡川(白锡川等,2010)推断桑花叶型萎缩病通过花粉、果实传染，还可通过土壤传染。但笔者认为上述途径传播的可能性不大，病毒只有在接触寄主并且有很好的感染部位时，感染才能进行。首先花粉、果实、土壤这些传染范围小，其次病毒很难打破桑树的表皮防御。夏志松等(夏志松和卢全有,2004)研究发现，对于外观健康的枝条，在高温隐症状态下具有很强的传染性，越冬枝条在春季嫁接时传染率更高。

在桑病毒病病原的鉴定上，由于病毒小、难分离、不可培养等特点，使它在柯赫式法则验证上存在困难，以至于阻碍了桑病毒病的发展。桑病毒病的防控主要靠隔离病原，由于桑病毒病存在潜隐现象，在不适宜的条件不会产生病症，以至于难以辨别没有症状的桑叶是否携带病原，以至于很难隔离防控。

近年来，国内关于桑花叶型萎缩病的研究报道较多，且聚焦于该病病原的鉴定。其病原至今未完全确定，从将其病原鉴定为类病毒(卢全有和夏志松,2006；夏志松,2008)，到线型传多面体病毒(Lu,Wu,Xia,Xie,2015)，再到双生病毒(马宇欣，2015)。但这些只能说明这些病原与该病具有相关性，未能明确之间关系。但双生病毒与该病具有92.4％的相关性，只要存在这种病原基本上可以判定会发生着种病，将该病原作为检测对象具有很好的代表性。

至今桑病毒病都是通过发病后病症来判断，还没有一种分子检测的方法。随着分子生物学技术的发展，分子检测技术以其快速、灵敏等优势逐渐成为重要检测手段。NCBI已报道多种桑花叶型萎缩病相关病毒核酸序列，该核酸序列为病毒全基因组，其中存在5个基因，表达出5种蛋白，分别是V2蛋白、V3蛋白、coat蛋白、Rep蛋白及RepA蛋白。外壳蛋白作为病毒特殊部分，是病毒产生免疫的关键成分，具有很高的特异性。