[发明专利]一种基于肽段C末端选择性酶标记的质谱从头测序方法

说明书

本发明涉及一种基于肽段C末端选择性酶标记的质谱从头测序方法及其应用。所述的方法是在肽段C末端酰胺酶的催化作用下，肽段C末端的羧基直接通过酰胺化反应标记上带碱性基团的小分子或者先通过酰胺化反应标记上带氨基的不饱和烃类，进一步通过叠氮‑炔基或者巯基‑烯的点击化学反应连接上碱性功能分子。肽段C末端标记上的碱性分子增加二级质谱中y离子的数目，提高肽段在质谱中的响应和碎裂效率，从而实现肽段测序。

技术领域

本发明涉及一种基于肽段C末端选择性酶标记的质谱从头测序方法及其应用。

背景技术

多肽是蛋白质的重要组成单元，广泛存在于生命系统中，在细胞分裂、生长等各领域发挥着重要作用。以多肽作为药物是近年药物市场研发的趋势之一，目前全球批准上市的多肽药物已超过80余种。然而很多活性多肽或者新开发的多肽药物的序列是未知的，对多肽以及多肽药物的测序有利于了解多肽的性质，对其活性和功能的发挥具有重要意义。而肽段的C末端测序具有很高的实用价值。早期的基于羧肽酶法的C端测序通过检测羧肽酶逐个释放氨基酸的顺序来判断蛋白/肽段的C端序列，费时费力，难以实现应用。化学法指的是蛋白质/多肽与化学试剂反应后,专一性的裂解并检测C端氨基酸的方法，由于标记试剂和裂解试剂的限制，导致产率低且灵敏度不高，一般只能测到C端5-6个氨基酸残基。串联质谱的发展为肽段C端从头测序分析提供了强有利的工具。但是长序列(15个氨基酸以上)的肽段的在串联质谱中无法获得完整的碎片离子信息，导致质谱数据的后处理不能拼接出完整的序列信息。在肽段C端标记上碱性小分子后可以丰富二级质谱中y离子的数目，提高肽段在质谱中的响应和碎裂效率，获得更多的碎片离子信息，有助于质谱从头测序。在肽段C末端的标记方法中，中科院微生物所吴边老师课题组发展的肽段C末端酰胺酶能够特异性催化C末端的羧基发生酰胺化反应，这种特异性酶标记方法新颖，特异性高，可以有效避免肽段侧链羧基发生反应(ACS Catal.2016,6,5405-5414)。因此，肽段C末端选择性酶标记结合质谱技术的从头测序方法具有广阔应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于肽段C末端选择性酶标记的质谱从头测序方法。为实现该目的，本方法采用的技术方案为：

(1)将100-1000μg肽段(单条肽段或蛋白酶解后的多肽混合物)粉末溶解于纯有机溶剂中：如，乙腈、丙酮、异丙醇、乙腈中加入0-5％的二甲亚砜、乙腈中加入0-5％的N,N-二甲基甲酰胺、丙酮中加入0-5％的二甲亚砜、丙酮中加入0-5％的N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇中加入0-5％的二甲亚砜、异丙醇中加入0-5％的N,N-二甲基甲酰胺中的一种，有机溶剂的体积在100-1000μL。

(2)在肽段溶液中加入1-20μL带有氨基的小分子，如：肼、乙二胺、丁二胺、戊二胺、环己二胺、三(2-氨基乙基)胺中的一种；或者丙烯胺、丙炔胺、2-丁烯胺、3-丁炔胺中的一种。

(3)将上一步得到肽段溶液转移到特异性C末端酰胺酶中进行反应，时间为12-72h，酰胺酶的用量在50-500mg，反应温度为25-50℃。

(4)第(3)步反应完毕后，针对直接标记的反应体系：离心5-30min后取上清冻干，用10-50μL的甲酸水溶液复溶，进行质谱鉴定。根据二级质谱中碎片离子的碎裂规律的特点，推导出肽段的序列。

(5)第(3)步反应完毕后，针对分步反应的反应体系可选择路线一(针对上一步标记上的是丙炔胺、3-丁炔胺中的一种)：离心5-30min后取上清冻干，加入100-1000μL的1×PBS复溶。加入1-100μL母液为20mM的N,N-二甲基叠氮乙基胺或3-叠氮基丙胺使其终浓度为20-2000μM，加入1-50μL母液为2M的抗坏血酸钠使其终浓度为2-100mM，加入1-50μL母液为100mM的三(3-羟基丙基三唑基甲基)胺使其终浓度为1-25mM，加入1-50μL母液为100mM的硫酸铜使其终浓度为100-5000μM，混合均匀后室温震荡30-180min。反应完毕进行除盐冻干，用10-50μL的甲酸水溶液复溶，进行质谱鉴定。根据二级质谱中碎片离子的碎裂规律的特点，推导出肽段的序列。