[发明专利]一种改进的重金属铜人工抗原的合成方法及NOTA在制备重金属铜人工抗原试剂中的用途

说明书

本发明提供了一种制备基于新型双功能螯合剂NOTA的重金属铜的人工抗原的合成方法，以2‑S‑(4‑氨基苯）‑1,4,7三氮杂环壬烷‑1,4,7‑三乙酸为螯合剂，将铜离子螯合剂复合物与载体蛋白牛血清白蛋白BSA和鸡卵清蛋白OVA偶联，制备人工抗原，该方法在原来传统基础上增加了采用硼氢化钠还原步骤，提高了偶联效率。本发明还提供NOTA在制备重金属铜的人工抗原上的应用。

技术领域

本发明涉及一种采用新型双功能螯合剂NOTA为连接载体的针对重金属铜的的人工抗原的合成技术,属于免疫化学技术中的人工抗原制备技术领域，可用于后续高特异性抗重金属铜抗体的制备和免疫分析技术的研究，并用于环境样品中微量和恒量重金属铜的检测。

背景技术

重金属污染主要指铅、镉、汞、镍、铬、砷、锌、铜等污染物。重金属分布广泛、难以降解，可通过大气、水、食物链进入人体，与体内蛋白质及各种酶发生作用，使它们失去活性，并在某些器官中富集，如果超过人体所能耐受的限度，会造成人体急性或慢性中毒，具有致癌、致畸及致突变作用，对人体具有很大的危害。根据第一次全国污染源普查结果，2007年全国废水中铅、汞、镉、铬、砷等五种重金属产生量为2.54万吨，排放量897.3吨。大气中上述五种重金属污染物排放量约9500吨。列入国家危险废物名录中含上述五种重金属的废物产生量为1690万吨，我国生态环境中重金属的污染形势非常严峻，污染事件时有发生，据统计，在2011年1到8月，全国发生了11起严重的重金属污染事件，如云南曲靖铬污染事故，广西柳州的龙江河镉污染事故，儿童血铅超标事件等，重金属污染事件对周边生态环境的影响范围之广、对民众生命健康的危害之大，引起了社会的高度关注。因此加强重金属在环境、农产品和食品中残留检测成为保障重金属安全的重要手段，而新形势下检测新技术的研究和开发显得尤为迫切。

传统的重金属检测方法多采用原子吸收光谱分析(Atomic AbsorptionSpectroscopy，AAS)、电感耦合等离子发射光谱(Inductively Coupledplasma AtomicEmission Spectroscopy，ICP-AES)、阳极溶出伏安法(Anodic Stripping Voltammetry,ASV)、色谱法和各种联用检测方法。这些方法虽然能对各种环境样品中的重金属离子进行有效分析，但大多需要大型仪器，分析方法成本高，样品需要经过消解，分析时间长，不适于重金属的现场快速检测，难以适应环境及市场产品的现场抽查、生产企业自查及产品进出口快速通关的要求。

免疫学检测技术具有检测速度快、分析容量大、费用低廉、仪器简单易携、使用人员技术要求不高，容易普及和推广、灵敏度高和选择性强等优点，尤其适合现场筛选和大量样品的快速分析，已成为21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。以该技术为基础开发的一系列检测产品，如ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、免疫传感器等已广泛应用于现场样品和大量样品的快速检测。

重金属离子免疫检测的关键在于抗重金属特异性抗体的制备，而特异性抗体制备的关键又在于优质重金属免疫原的合成。一方面，由于重金属离子带有电荷，能与动物体内生物分子发生强烈的不可逆反应，引起动物中毒反应；另一方面，重金属的分子量低，不具有免疫原性，需将它与载体蛋白偶联，才能形成完整的免疫原，但是由于重金属离子直接与蛋白连接，会使蛋白质变性，因此，需利用双功能螯合剂螯合重金属离子，制备金属-螯合剂复合物，将该复合物再与蛋白偶联后制备完全抗原，进而免疫动物制备特异性抗体。采取的是一种开环式的双功能螯合剂进行螯合，后再与载体蛋白偶联制备人工抗原进行动物免疫和抗体的制备，在此基础上建立不同的免疫分析技术和方法。