[发明专利]一种测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法

说明书

本发明公开了一种测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法，通过制备含有细菌抑制剂的病原真菌或生防真菌孢子悬浮液、制备含有细菌抑制剂的生防细菌发酵液、共培养、抑菌圈测定等简易程序进行抗菌活性测定。本发明具有技术上的创新性，可替代目前常见的过滤法等测定拮抗活性的方法，既能真实反应生防细菌代谢产物的活性，又具有试验稳定性好、重复性好、操作简便、抗污染能力强、周期短和效率高等优点，可简便快速的实现多种生防细菌对多种病原真菌/生防真菌的拮抗活性的大量测定，有利于快速评价生防细菌对病原真菌/生防真菌的拮抗活性，对研制复合生防细菌和生防真菌制剂也具有重要意义。

技术领域

本发明属于植物病理学和微生物学领域，更具体涉及一种微生物菌剂研制中所必须的生防细菌代谢产物对植物病原真菌或生防真菌拮抗活性的测定方法。

背景技术

由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora nicotianae)引起的作物枯萎病、瘟病等毁灭性土传病害，以及灰梨孢菌(Magnaporthe oryzae)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的作物炭疽病、稻瘟病等叶面病害给我国农业生产造成巨大损失。生物防治是近年来发展起来的前沿技术，具有安全，环保的优势，已成为研究热点。自然界中存在的芽孢杆菌等生防细菌对植物病原真菌具有抑菌活性，在对峙培养中表现为与病原菌竞争营养、分泌代谢产物引起病原菌菌丝消解、断裂，抑制孢子萌发，形成抑菌带；拟青霉、木霉等生防真菌具有营养竞争、分泌代谢产物抑制病原菌生长的特点，上述生防菌在田间应用中具有实用环保的优势，然而单一种类的生防细菌或真菌制剂由于功能单一常导致田间应用效果不稳定，因此选择具有兼容性的生防细菌和生防真菌研制复合制剂具有广阔应用前景。

测定生防细菌代谢产物对植物病原菌/病害生防真菌的拮抗活性是微生物菌制剂研制过程中的关键环节，但目前常见的用于生防细菌代谢产物活性测定方法如平板对峙培法、菌体直接作用法、三明治法、过滤法(过滤器过滤、双层培养基滤纸夹心法)等均需要在无菌条件下操作，同时还存在其他明显的局限性：

1)平板对峙培法、菌体直接作用法和三明治法存在稳定性、重复性差的局限：

(1)平板对峙法：通常在平板培养基上的病原菌周围点接生防细菌进行对峙培养，根据病原菌与生防菌之间形成的抑菌带宽度判断生防细菌的拮抗活性强弱。此法虽操作比较简便，但由于点接生防细菌的接种量、与病原菌的距离，导致分泌活性物质产量和形成抑菌带宽度也不一致，同时细菌菌体生长也会与病原菌形成营养竞争，影响病原菌生长，无法真实反应出细菌代谢产物的拮抗活性，此法仅适合于生防细菌的初筛。

(2)菌体直接作用测定法：通常是取生防细菌菌体或含菌体的发酵液，涂布至平板培养基表面或混合于培养基制成含菌的平板，然后在含菌的平板上接入病菌块，测定病菌菌落生长直径。采用此法，由于细菌菌体快速生长与病原菌形成营养竞争，对病菌生长影响也极大，仅适合判断细菌营养竞争力，无法真实反应出细菌代谢产物的拮抗活性。

(3)三明治法：在两层培养基中间为一层培养基与拮抗菌菌液(含活菌体)的混合体，然后在上层培养基中接入病原菌菌块，但中间层培养基的菌体容易从上层培养基表面长出与病原菌形成营养竞争，对病菌生长影响极大，同时中层培养基缺乏氧气也会影响生防细菌代谢产物的正常分泌，无法真实反应出细菌代谢产物的拮抗活性。

(2)过滤法(过滤器过滤、双层培养基滤纸夹心法)存在操作繁琐、成本高和效率低的局限：

此类方法虽然通过过滤提高了测定结果的准确性，但在操作过程中需要通过离心、细菌过滤器如微孔滤膜过滤去除细菌菌体等繁琐和费用高的环节，才能避免细菌生长对测定结果的干扰；专利(ZL200810071987.0)公开了一种双层培养基滤纸夹心法，取生防细菌涂布至上层培养基后，生长分泌的代谢产物通过滤纸扩散到下层培养基，移除滤纸和上层培养基后，接入病原菌菌块至下层培养基，培养后测定菌落直径。但测定需要4-7d，周期较长，单个平板培养基只能测定一种生防细菌对一种病原真菌的拮抗活性。