[发明专利]一种甲基营养型芽孢杆菌B18及其液体制剂的制备和应用

说明书

本发明公开了一种甲基营养型芽孢杆菌B18及其液体制剂的制备和应用，该菌株已经于2017年9月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14641。以甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种，经种子培养、发酵培养可制备得到液体制剂。本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌B18对黄柏烂皮病有特效，且具有抗逆性，贮藏性好，抗高温、低温、耐干燥，适宜于商品化生产，不仅能避免化学药物所造成的污染环境的严重后果，而且具有可持续、成本低的特点。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种甲基营养型芽孢杆菌B18菌株及其液体制剂和在黄柏烂皮病防治上的应用。

背景技术

黄柏是提取小檗碱的主要原料，也是我国重要经济树种和传统皮用类中药材，距今已有2000多年的药用历史，树皮含多种生物碱，有特殊香气与苦味，具有泻火除蒸、泻火解毒、消肿祛腐等功效，是宝贵的药用资源。黄柏皮为临床常用的清热燥湿的中药，用途广泛，市场需求量大，可制成多种中成药，化妆品、生物农药等，对人民的生活健康具有重要价值。此外，黄柏是珍贵的用材树种，木材淡黄色、纹理直且结构细，不翘裂，材质好，坚韧富有弹性，耐水湿、腐性强，易加工，是上等的工业用材。加之其树冠宽阔，树形高大，夏季枝繁叶茂，可形成不错的浓荫效果，也可作为园林树种。广泛栽植不但美化环境，而且活跃经济。其产量主要来自野生资源，近年来由于需求量较大，加之黄柏为多年生木本药材，生长周期较长，药材供不应求。

在黄柏的生长过程中易发生烂皮病，表现为枝干产生圆形至椭圆形暗褐色病斑，病部变软呈水渍状，后期因失水而干缩，产生龟裂，严重时造成叶片发黄、脱落、枝干枯死。当林内湿度较大时，树干上有大量橘黄色的丝状物长出，为病菌的分生孢子角。目前，这方面尚无专项研究。目前生产中主要通过营林措施清除病源来进行防治，一般以化学农药、化学肥料为主，但由于长时期施用化学农药(肥料)易污染环境，破坏生态，病害综合防治措施的探讨还有待开展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在防治黄柏烂皮病中的缺陷，提供了甲基营养型芽孢杆菌B18及其液体制剂在防治黄柏烂皮病中的应用。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)B18菌株于2016年11月20日采用平板稀释涂布法分离于四川大邑仰天窝药场健康杜仲树皮，已经于2017年9月18日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.14641。

本发明甲基营养型芽孢杆菌B18在NA平板培养基上培养了2d的单菌落呈白色，圆形，边缘不整齐，表面干燥，有褶皱，无粘性，不透明。

本发明甲基营养型芽孢杆菌B18的16S rDNA的序列为：SEQ ID NO:1。

本发明以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的液体制剂，由甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种，经种子培养、发酵培养得到液体制剂。

本发明所述的以甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种的液体制剂中含活芽孢数不低于1×10⁹cfu/g。

本发明所述的以甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种的液体制剂通过以下方法制备：

1)一级斜面种子：制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种甲基营养型芽孢杆菌后，培养制成一级种子；

2)二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种甲基营养型芽孢杆菌斜面种子，振荡培养，制成甲基营养型芽孢杆菌液体种子；