[发明专利]一种提高米尔贝霉素发酵产物中米尔贝霉素A3含量的方法

说明书

本发明公开了一种提高米尔贝霉素发酵产物中米尔贝霉素A3含量的方法，包括：斜面菌种培养，液体种子培养，液体发酵培养等步骤，发酵培养过程中向发酵液中流加补料蔗糖溶液，尤其发酵到48h后，通过向发酵液中每天间歇或连续补入特异性的前体0.05％的乙酸钠溶液，显著提高了发酵产物中A3的含量，同时也提高了米尔贝霉素的发酵产量。

技术领域

本发明涉及一种米尔贝霉素的发酵工艺，属于生物制药技术领域，特别涉及到用微生物液体深层发酵技术生产米尔贝霉素的方法。

背景技术

米尔贝霉素(Milbemycin)是一系列十六元大环内酯类抗生素的混合物，由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)经发酵产生。米尔贝霉素的20多种组分中大多数对农业害虫具有广谱防治活性，如蚜、螨、黄褐天幕毛虫、肠道寄生虫以及其他危害作物及家畜的寄生虫，尤其对各种螨类都有较高的防治效果。米尔贝霉素具有对害虫作用强烈，用药量少，对人畜安全，不污染环境，只杀害虫，不杀害虫天敌，也不易产生抗药性的特点，是一种非常有前途的广谱、高效、新型无交叉抗性的生物杀虫剂。

在米尔贝霉素系列药物中，由于米尔贝霉素A3、A4的生物活性较强，产量较高，所以米尔贝霉素产品的商业化都围绕着米尔贝霉素A3、A4来进行。除了米尔贝霉素A3、A4的混合物广泛被用作杀螨剂以外，米尔贝霉素A3、A4的半合成肟化产物，米尔贝肟(Milbemycinoxime，米尔贝肟，CAS号:129496-10-2)，是一种新型的大环内脂类驱虫药，对体内体外寄生虫均有良好的驱杀作用，对控制和预防大部分常见的宠物寄生虫病都有很好的效果。米尔贝肟尤其是以其低毒高效的特点被公认为是一种广谱、高效、安全的驱虫药，特别是对一些对伊维菌素敏感的犬只更为安全。

米尔贝肟由米尔贝肟A3和米尔贝肟A4以一定比例混合组成，要求米尔贝肟A3+A4的含量不应小于95％，其中A3和A4的比例为(20±5)：(80±5)。米尔贝肟A3、A4的结构式如下式所示：

米尔贝肟A3(Milbemycin Oxime A3)：R＝CH₃

米尔贝肟A4(Milbemycin Oxime A4)：R＝CH₂CH₃

工业上主要用吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)发酵生产米尔贝霉素，在发酵过程中，米尔贝霉素A3、A4是被菌体同时产生的，以混合物的形式存在于发酵液中。由于A3、A4的结构和性质都非常相似，仅仅在C-25上的取代基不同，分别是甲基和乙基，从发酵液中分离出A3、A4单一组分非常困难，所以目前工业上一般都把A3、A4视为同一组分，一起从发酵液中提取分离出来，再经过氧化、肟化等一系列的半合成步骤后，最后经过分离纯化得到米尔贝肟成品。这就要求从一开始，发酵液中的米尔贝霉素A3与A4的比例就必须恰好是在(20±5)：(80±5)范围内，这样最后得到的米尔贝肟A3与A4的比例才能够符合要求。

目前国内米尔贝肟的发酵生产中遇到一个难题，每批发酵随着发酵进程的持续，米尔贝霉素总体发酵单位持续增长，但发酵中后期A3的发酵单位增长相对较慢，导致A3/A4的比例也在不断的下降，从发酵中期的1:3左右，到放罐前下降到1:7左右，而最终产品的要求是1:4左右，所以经常不得不在发酵单位还较低的时候就提前放罐。生产中遇到的这个难题就急需要找到一种方法，能够特异性的提高A3的产量，而不影响A4的产量，这样不仅能从整体上提高了米尔贝霉素的产量，而且还能够大大降低后续半合成生产米尔贝肟的难度，大幅度降低生产成本。