[发明专利]一种催化柚皮素生成山萘酚的融合酶及其应用

说明书

一种催化柚皮素生成山萘酚的融合酶及其应用，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。本发明通过组合筛选策略获得能有效催化柚皮素生成山萘酚的黄烷酮3‑羟化酶（PeF3H）和黄酮醇合成酶（CuFLS），是目前报道的最佳组合。通过连接肽的筛选，获得了能适合PeF3H和CuFLS功能化融合的连接肽TPTPTPTP，通过该连接肽构建的融合酶（F69）能高效催化柚皮素生成山萘酚。携带该融合酶（F69）的重组菌BL21‑F69，通过高密度发酵，山萘酚的产量达到1010.2 mg/L，是目前报道最高产量的17倍。

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种融合酶的构建及其在催化柚皮素产山萘酚中的应用。

背景技术

山萘酚属于黄酮类化合物，分子式为C₁₅H₁₀O₆，分子量为286.23。山萘酚广泛存在于多种植物中，具有抗氧化、抗炎症、抗癌等多种细胞保护功能。(1)抗氧化作用：山奈酚具有抑制AGE(Advanced glycation endproducts)形成和消除自由基功能，在预防细胞内酯类及DNA氧化损伤等方面具有较强抗氧化作用；(2)抗炎症作用：山萘酚作用于血管上皮细胞即表现出明显的抗炎症作用，效果强于其结构类似物槲皮素；研究还发现，人类口服低剂量山萘酚较槲皮素更易于吸收。山萘酚还能有效抑制一氧化氮生成，下调炎症反应中iNOS、TNF-a、NF-kB等因子的表达，从而有助于保护大脑，预防缺血性中风导致的脑损伤以及其它慢性炎症疾病；(3)抗癌作用：山萘酚通过激活前凋亡因子、抗肿瘤细胞增殖和生长等作用，能够诱导肿瘤细胞凋亡并降低各种癌症如肺癌、大肠癌、卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌等的发病率。随着对山萘酚作用机理的深入研究，逐步发现山萘酚在预防动脉粥样硬化和糖尿病、抗衰老、抗微生物感染等方面具有特殊功效。而且山萘酚也是银杏叶提取物(GBE)重要的功能性化合物，也是其质量控制的标志性化合物之一。

目前山萘酚主要从桑叶、银杏等植物中通过提取制备，但其在植物中含量很低，因此通过提取分离手段制备难度大、产率低、成本高，且受植物分布、种类等因素限制(中国发明专利ZL200610152524.6)。由此可见，如何有效获取山萘酚是值得我们去深入研究的重大科技问题，解决这一问题，无疑对人类疾病的预防和治疗具有重要意义。柚皮素是山萘酚的前体化合物，植物通过合成途径关键酶黄烷酮3-羟化酶(F3H)催化柚皮素生成二氢山萘酚，二氢山萘酚再通过黄酮醇合成酶(FLS)的催化生成山萘酚。但目前报道的催化柚皮素生成山萘酚的产量还很低。分析可能的原因是：(1)黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄酮醇合成酶(FLS)催化能力还有待提高，需要筛选催化效率更高的基因源；(2)F3H和FLS的催化能力不匹配，容易造成二氢山萘酚的积累。

由此可见，获得催化性能优异的黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄酮醇合成酶(FLS)是高效催化柚皮素制备山萘酚的关键因素之一。但目前只有有限的几个基因已经克隆、表达并定性，因此我们无法通过文献报道获得催化性能优异的酶基因。本研究主要通过组合筛选策略对不同来源的黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄酮醇合成酶(FLS)基因进行了筛选，获得了最佳组合。另一方面，融合酶技术也被广泛应用异源合成途径的构建，通过融合酶技术可有效降低中间产物的生成，并能大幅提高目标产物的产量。但融合酶技术需要通过合适的连接肽才能使融合酶正确折叠，发挥催化作用。因此本研究另一方面的工作是对合适的连接肽进行筛选，获得最有利于融合酶发挥催化功能的连接肽。最终使融合酶能有效减少中间产物二氢山萘酚的产生，从而解除了中间产物对菌体生长的影响，实现了山萘酚的高效合成。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供了一种催化柚皮素生成山萘酚的融合酶及其应用，携带该融合酶基因的重组菌能高效转化柚皮素制备山萘酚。

技术方案:一种催化柚皮素生成山萘酚的融合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

催化柚皮素生成山萘酚的融合酶，连接肽为TPTPTPTP。

编码上述融合酶的基因，核酸序列如SEQ ID NO:10所示。