[发明专利]一种稻米淀粉粒断面的制备及观察分析方法

说明书

本发明公开了一种稻米淀粉粒断面的制备及观察分析方法，主要针对暗胚乳和糯稻稻米横断面中淀粉粒中间孔洞的观察。该方法是选择暗胚乳和糯稻稻谷；手动剥壳获得糙米或者选择机械脱壳、出精后无明显裂纹的精米，并用干冰‑液氮混合物速冻；迅速断裂；修块并固定在载物台上观察和分析。本发明方法的优点是操作简单、快速和成本低廉，能够有效的对单个淀粉粒进行断裂从而观察到单个淀粉粒内部的结构，克服了常规稻米断裂方法无法断开淀粉粒的缺陷，为稻米外观分析尤其是稻米透明度的研究提供了重要技术支持，对稻米外观品质改良研究具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物材料的扫描电子显微镜观察技术领域，特别是涉及水稻暗胚乳和糯稻稻米淀粉粒断面孔观察的样品制备及分析方法。

背景技术

稻米透明度是目前育种家和广大消费者关心的重要性状，也是优质稻米定级的一个重要指标。一般常规的粳稻和籼稻稻米在透明度评价中都能够达到优质稻米的要求，然而对于近年来大量上市的软米而言，由于其直链淀粉含量普遍较低，在水分含量较低的情况下稻米的透明度会极显著下降而往往达不到优质稻米标准。稻米中的主要成分是淀粉，后者包括直链淀粉和支链淀粉，其中直链淀粉的含量对稻米的透明度影响非常大，尤其是在含量比较低的时候会造成暗胚乳表型，不含直链淀粉的稻米表现为糯稻表型。在遗传研究方面已经非常明确Wx基因的不同等位变异是造成稻米直链淀粉含量改变的直接原因，但是对于稻米透明度尤其是暗胚乳和糯稻的较差透明度形成的淀粉结构基础目前并不明确。

稻米胚乳中淀粉粒的结构观察是目前研究各种水稻胚乳突变体的重要方式，一般认为稻米灌浆不充实和高垩白的稻米胚乳中存在明显的区域性的松散排列淀粉粒，并且由于松散排列淀粉粒间空腔对光线的折射而造成了垩白区的不透明表型。但暗胚乳和糯稻尽管透明度低或不透明，其胚乳淀粉粒仍排列紧密，无法用淀粉粒排列松散来解释。由于通过常规的稻米制样和扫描电子显微镜观察只能观察到稻米横断面中完整淀粉粒的结构和彼此间的排列方式，对于单个淀粉粒中间的结构(是否存在空腔)观察由于缺乏有效的断开单个淀粉粒的方法而难以完成淀粉粒内部结构的观察。尽管有研究表明可以通过激光共聚焦显微镜的光学切片功能对淀粉粒内部进行观察，但由于在观察之前需要对样品进行淀粉粒进行分离，处理过程复杂且有可能会对淀粉粒结构产生影响，另一方面，由于稻米淀粉粒非常小，激光共聚焦显微镜无法完成淀粉粒的精细分析。因此亟需通过对现有用于扫描电子显微镜分析的样品制备方法进行改进，发明一种稻米淀粉粒断面的制备及分析方法，为研究稻米透明度的成因以及在稻米淀粉结构研究方面提供技术支持。

发明内容

为克服当下稻米胚乳中淀粉粒内部结构无法分析的不足，本发明提供一种稻米淀粉粒断面的制备及分析方法。

本发明所采用的技术方案如下：

一种稻米淀粉粒断面的制备及观察分析方法，是选择暗胚乳和糯稻稻谷；剥壳获得糙米或出糙获得精米并用干冰-液氮混合物速冻；迅速断裂；修块并固定在载物台上观察和分析。

具体步骤如下：

(1)样品选择和准备：选择自然干燥或烘干的暗胚乳和糯稻稻谷，手动剥壳获得糙米或者选择机械脱壳、出精后无明显裂纹的精米；每个样品的数量可根据需要确定；

(2)样品断裂：用镊子夹住每粒样品置于干冰-液氮混合物中速冻1-2分钟，取出后迅速用尖头钢丝钳固定籽粒一端，另一端用镊子用力掰断。选择断面平整的进行后续试验；

(3)修块：选取断面平整的一半稻米，用镊子固定带有断面的一段，用刀片切除断面相对的一部分，并修整切口，使切口平整且与米粒保持垂直。修整后的断面厚度保留2-3mm，并且用记号笔在修整的断面上点一个点计作粘贴面，选择3粒切口平整的小块用于后续试验；

(4)样品固定：用镊子将修整后的样品块有黑点的断面朝下粘在样品台上的导电胶上，确保样品垂直放置且整个操作过程不能用手触碰上断面，每个样品固定3个小块；