[发明专利]基因改造方法

权利要求书

1.一种基因改造方法，其特征在于，包括：

对模式动物体内的未成熟卵母细胞原位显微注射基因改造试剂；

所述基因改造试剂包括选自gRNA、质粒、mRNA、蛋白质、染料和/或Morpholino的至少之一；

所述gRNA，质粒，mRNA，蛋白质、染料和/或Morpholino预先稀释在缓冲溶液中，所述缓冲溶液含有5.4mM KCl，136.8mM NaCl，4.2mM NaHCO₃，0.44mM KH₂PO₄，0.25mM Na₂HPO₄以及100nM的褪黑素；

所述模式动物是斑马鱼；

所述斑马鱼的年龄是6个月～1年；

进行所述原位显微注射处理前，对所述年龄为6个月～1年的斑马鱼进行驯化处理；

其中，所述驯化处理是通过如下方式进行的：

(1)让所述斑马鱼每周交配一次，以便卵母细胞成熟形成规律的周期；

(2)卵母细胞成熟形成规律的周期后，让所述斑马鱼休息两周，以便卵母细胞得到积累；

所述原位显微注射前，将所述斑马鱼进行麻醉处理，并置于湿润的海绵上，所述湿润的海绵是将海绵在含有5.4mM KCl，136.8mM NaCl，4.2mM NaHCO₃，0.44mM KH₂PO₄，0.25mMNa₂HPO₄以及0.5％质量体积比的BSA的溶液中浸润后获得的；

所述未成熟卵母细胞为I期、II期或III期的卵母细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原位显微注射前2-3小时内对所述斑马鱼进行禁食处理。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行原位显微注射后，将所述斑马鱼进行恢复饲养处理和交配处理，所述恢复饲养处理是通过如下方式进行的：

(1)将所述斑马鱼置于含有32μg/ml的麻醉剂以及10units/ml Penicillin和10μg/mlStreptomycin的水中进行单独饲养，以便于所述斑马鱼恢复意识；

(2)将恢复意识的斑马鱼在温度为28℃的条件下饲养2～3小时；

(3)将步骤(2)获得的斑马鱼置于含有16μg/ml的麻醉剂以及10units/ml Penicillin和10μg/ml Streptomycin的水中进行单独饲养过夜；

(4)将步骤(3)获得的斑马鱼置于含有8μg/ml的麻醉剂以及10units/ml Penicillin和10μg/ml Streptomycin的水中进行单独饲养10～12小时，以便获得待交配斑马鱼。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述未成熟卵母细胞为I期或II期卵母细胞，注射完的斑马鱼完成交配后，将所述斑马鱼体内的未经过原位显微注射处理的III期卵母细胞经信号刺激后成熟并排出体外。