[发明专利]基因改造方法

说明书

本发明提出了一种基因改造方法。该方法包括：对模式动物体内的未成熟卵母细胞原位显微注射基因改造试剂。利用根据本发明实施例的基因改造方法，将显微注射的时间提前到卵子还未成熟的时期，并且采用在母体内直接注射的办法，注射后的卵母细胞在母体内自然成熟后，被排出并受精，能在F0代得到几乎所有细胞基因组都被编辑的突变体，在注射的当代胚胎里就能看到和纯合突变体一致的表型，以及稳定表达的转基因图谱，相比现有技术，突变体获得时间缩短为2‑3个月，并且无需进行大规模的筛选工作。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及基因改造方法。

背景技术

以斑马鱼(Danio rerio)为例，斑马鱼是典型的发育生物学模式生物之一，其卵子在体外进行受精和早期胚胎发育。雌鱼排出未受精的成熟卵子，同时雄鱼排出精子，两者在体外完成受精过程。并且斑马鱼早期胚胎是透明的，便于观察和实验操作。现有胚胎显微注射技术是对在体外成功受精的受精卵进行的显微注射。它是将受精后还未进行有丝分裂的胚胎置于由琼脂凝固而成的带孔注射盘内，用玻璃毛细吸管加热拉制而成的玻璃针在显微镜下进行的注射。注射针固定在持针器上，操作简单方便。注射的物质可以是mRNA，蛋白质，DNA，反义寡核苷酸(Morpholino)，以及其他小分子物质，可短时间内对大量胚胎进行注射(平均每30分钟注射200枚胚胎)。注射完成后，将胚胎从琼脂盘中冲洗下来，置于胚胎专用的培养水中，与28-30℃的培养箱中进行培养。

受精后，斑马鱼早期胚胎会进入快速卵裂期，时间间隔大概是：受精到第一次细胞分裂完成是45分钟；随后进行大约十次快速细胞分裂，每次间隔15分钟；然后胚胎的合子基因开始大量激活，胚胎逐步开始原肠运动(Kimmel et al.,1995)。现有显微注射技术受限于早期胚胎的快速分裂，注射操作必须在40分钟内完成，并且注射到胚胎里的试剂无法充分的发挥作用便被快速分裂的细胞稀释掉了；以至于单个细胞内的注射试剂含量快速下降，作用效率降低。在构建CRISPR/Cas9突变体的时候，由于注射到胚胎里的gRNA和Cas9mRNA或者蛋白质被快速分散到各个细胞中，无法保证所有细胞的基因组都被它们编辑，更无法保证生殖细胞内的基因组被编辑，所以通常只能得到F0代的生殖细胞嵌合体；然后需要花费大量的时间和精力进行筛选，最终需要6个月甚至一年的时间才能得到稳定的突变体品系(Chang et al.,2013；Hwang et al.,2013；Varshney et al.,2015)。对于转基因鱼的构建也是类似的情况，Tol2转座酶mRNA和质粒DNA也会在注射后因为胚胎细胞的快速分裂而被稀释，导致转基因插入只发生在部分细胞中，也需要大量的时间和精力进行筛选才能得到稳定的转基因品系(Hamlet et al.,2006；Kawakami,2007)。更重要的是，当需要同时敲除几个，甚至几十个功能冗余的基因时；或者得到多重转基因鱼时，胚胎显微注射技术需要花费巨大的时间和精力，有时甚至无法办到。

目前，在斑马鱼研究领域，某些母源基因敲除或者敲低是现有的胚胎显微注射无法办到的。在许多物种的早期胚胎发育过程，卵子需要积累大量的母源mRNA和蛋白质，这些物质对早期胚胎发育十分重要。但是当需要研究某些母源基因的功能时，需要敲低或者敲除这些基因，但是许多纯合子突变体是致死的或者不育的，无法得到母源合子突变体；在合子基因激活前的短时间内也无法被注射的Morpolino快速封闭；最终导致敲低某个母源表达的基因时，效率不高，有时甚至是无效的。

胚胎的显微注射技术在其他物种中也得到了广泛的应用。例如小鼠(Mice)和非洲爪蟾(Xenopus)，由于小鼠胚胎是体内发育，所以显微注射技术涉及到将供体雌鼠处死取卵或者胚胎，然后将注射后的卵子进行体外受精培养(胚胎则无需体外受精)，最后将存活的胚胎移植到受体雌鼠的子宫等待产出；此操作非常复杂，成功率低并且对技术要求极高。对于非洲爪蟾，卵子显微注射技术也是现将卵子从母体取出，注射然后放入母体继续发育，产出；而胚胎的显微注射也面临和斑马鱼胚胎显微注射一样的问题。上述所有现有技术均是将注射的卵母细胞或者受精卵从母体中取出进行体外培养和显微注射后，再体外受精或者移植到另一母体内继续发育。