[发明专利]一种抗PRRSV的miRNA重组质粒的制备及其应用

说明书

本发明属于动物繁殖与病毒学技术领域，具体涉及一种抗PRRSV的miRNA重组质粒的制备及其应用。发明步骤如下：通过融合PCR制备猪Let‑7家族成员ssc‑let‑7a、ssc‑let‑7c、ssc‑let‑7d、ssc‑let‑7e、ssc‑let‑7f、ssc‑let‑7g、ssc‑let‑7i、ssc‑mir‑98的重组序列(该重组序列如SEQ ID NO:1所示)，构建共表达重组质粒pEGFP‑N1‑Let‑7；在细胞水平和活体水平上分别检测重组质粒对PRRSV的抑制作用。本发明为猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)的防控和药物、疫苗的制备提供了新的质粒资源。

技术领域

本发明属于动物繁殖与病毒学技术领域，具体涉及一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的miRNA重组质 粒的制备及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起。PRRSV是有囊膜的单股 正链RNA病毒，属动脉炎病毒科动脉炎病毒属(Cavanagh D 1997)。PRRSV基因组全长14.5kb，有9个开 放阅读框，分别编码膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)、糖基化蛋白(GPs)和非结构蛋白(Nsps)。猪繁殖与呼吸综 合征主要以怀孕母猪流产及仔猪的呼吸道症状为特征，具有较高的死亡率和较低的治愈率(MurtaughM et al 2002)。目前，猪繁殖与呼吸综合征仅见于猪，其他家畜未见发病。PRRS自在北美爆发以来，已席卷了世 界上大部分养猪国家。2006年，在我国爆发了以高热、高发病率和高死亡率为特征的严重型PRRS，疫情 给我国的生猪产业带来了灾难性的冲击，造成了巨大的经济损失。

miRNA是转录后起调控作用的一类内源性非编码小RNA，通过与靶基因的3’UTR结合，抑制靶基因 的翻译或导致其降解，从而实现对靶基因的调控。越来越多的研究表明miRNA在免疫细胞的发育、分化、 非特异性免疫、特异性免疫应答及疾病发展中都发挥着重要的调节作用。miRNA在病毒感染和宿主天然 免疫中起关键作用，参与病毒与宿主的互作，它有可能是宿主最原始的免疫方式(Agudo et al，2014)。 miRNA能作为宿主的抗病毒因子，作用于病毒的RNA，显著抑制病毒复制(Lecellier et al，2005)。有研 究表明mir-181能够通过体外给药的形式抑制病毒在体内复制(Guo et al，2013)。

Let-7家族是目前研究最为广泛的miRNA家族之一。由Let-7a、Let-7b、Let-7c、Let-7d、Let-7e、Let-7f、 Let-7g、Let-7i、及mir-98组成，广泛参与多种生物过程。有研究表明Let-7g抑制HBV preS2蛋白的表达 和病毒的复制(Takata et al 2016)。此外，在猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究中，let-7g能够靶向PRRSV 基因组的NSP2，抑制PRRSV在Marc-145细胞的增殖(钟瑶2013)。

因此，筛选和鉴定对PRRSV感染具有重要调控功能的miRNA，分析miRNA在PRRSV感染中的作 用，将加深对PRRSV感染的免疫抑制机理与其致病机理的认识，同时为研究其它动物病毒与宿主之间的 相互作用机制提供新思路。另外，制备抗病毒miRNA及多个具有相似作用的miRNA重组质粒或抗miRNA 寡核苷酸(anti-microRNA oligonueleotides，AMOs)也是一种理想的治疗手段(Pillai et al.,2005；Nottrott et al.,2006；Wang,2011)，有助于建立miRNA新疗法，应用于PRRSV等病毒的防治。

发明内容

本发明的目的在于分离克隆猪Let-7家族miRNAs，构建Let-7家族miRNAs表达重组质粒pEGFP-N1 -Let-7，鉴定其在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制中的作用，应用于PRRSV的防控等领域。