[发明专利]一种用于伤口愈合的干细胞分泌因子精华液的制备方法

权利要求书

1.脐带的选取：选取1根健康产妇正常分娩的脐带组织，为孕妇自愿的前提下选取，2℃～8℃条件下保存。

2.分离脐带组织：根据权利要求1中取得的脐带组织，在24小时内将包含间充质部分的组织块分离出来，过程如下：将脐带组织置于百级超净台环境下的培养皿中，用PBS将组织表面的血迹冲洗干净，将脐带组织剪成小段，并将脐带内血管去除，后将脐带表面的羊膜组织也剥离开，剩余的部分用镊子和手术刀分离开，得到含有间充质干细胞的组织块。

3.组织块的培养：将组织块转移到150mm的培养皿中，用18号手术刀片切割成1mm³左右的小块，将小组织块转移到T175的培养瓶中，加入脐带间充质干细胞专用培养基，37℃、5%CO₂培养箱中进行培养。

4.获取P2代细胞：观察脐带间充质干细胞的生长状态，当汇合度达到50%的时候将培养瓶中的组织块取出，继续培养，当汇合度达到90%左右的时候胰蛋白酶消化，获取P1代细胞，P1代细胞转移到T175的培养瓶中继续培养，当汇合度达到90%左右的时候胰酶消化，获得P2代细胞。

5.获取干细胞培养上清原液：将P2代细胞以1×10⁴/cm²接种密度分别接种到5个T175的培养瓶中培养，37℃、5%CO₂培养箱中培养48小时，当P2代细胞生长汇合度达到85%-90%的时候，收取P2代细胞的培养上清原液，-20℃储存备用。

6.获取浓缩精华液：对权利要求5的上清液在3000rpm条件下离心10分钟，留上清弃沉淀；然后通过100KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过3KD超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩精华液，经过滤器除菌过滤后，经安瓿瓶进行分装。

7.伤口愈合因子浓度检测：用ELISA方法检测权利要求5中留取的上清原液样品和权利要求6中留取的精华液样品中白细胞介素 8（IL8），白细胞介素 6（IL6），转化生长因子 1（TGF-β1），单核细胞趋化蛋白 1（MCP-1），血管内皮生长因子（VEGF），GM-CSF 和 TIMP-1 的浓度水平。

8.用于权利要求7中的脐带间充质干细胞培养上清原液和浓缩液待检样品，在检测前应恢复到室温，避免反复冻融。

9.实验以样本稀释液为空白对照，并作复孔检测，检测的整个过程要严格按照ELISA因子检测试剂盒说明书进行检测。

10.根据权利要求1-6所述的间充质干细胞因子精华液的制备方法，其特征在于，所述的脐带组织来源的间充质干细胞是通过以下方式获得的：（1）冲洗脐带组织，优选的使用含有青霉素-链霉素的氯化钠盐缓冲液冲洗脐带组织；（2）将脐带组织切成小块后，优选1mm³左右的小块，平铺于培养瓶底部，进行培养。

11.权利要求6中，选取的浓缩区间范围是3KD-100KD之间，其中要收集和检测的伤口愈合因子的分子量都在此范围内，其分别是：白细胞介素 8（IL8）分子量为69-79KD；白细胞介素6（IL6）分子量为21-30KD；转化生长因子 1（TGF-β1）分子量为44.3KD；单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）分子量为8-10KD；血管内皮生长因子（VEGF）分子量为34-45KD；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）分子量为18-22KD；基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1）分子量为25.21KD。

12.权利要求7中所用的检测试剂盒均为R&D System品牌的，先用试剂盒中的标准品测出各标准品的OD值，并制作标准曲线备用；样品在检测之前统一在冰箱中取出，恢复到室温，每个样品的每项检测指标均严格按照使用说明进行实验操作，将计算出的OD值根据各标准曲线换算成对应的浓度。