[发明专利]一种用于伤口愈合的干细胞分泌因子精华液的制备方法

说明书

本发明公开了一种适用伤口愈合的脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，它主要包括如下步骤：（1）脐带组织的选取；（2）分离并培养间充质干细胞；（3）获取P2代细胞并继续培养，收集培养上清原液；（4）对步骤（3）中获取的上清原液超滤浓缩获取精华液，并除菌安瓿瓶分装；（5）对步骤（3）中获取的干细胞培养上清原液和步骤（4）中获取的浓缩精华液，分别做伤口愈合因子：白细胞介素8（IL8），白细胞介素6（IL6），转化生长因子β1（TGF‑β1），单核细胞趋化蛋白1（MCP‑1），血管内皮生长因子，GM‑CSF和TIMP‑1的含量检测。本发明方法可以有效去除间充质干细胞培养上清液的杂质，而且得到的伤口愈合因子的纯度和产量都很高，安瓿瓶包装保障了精华液的产品质量，方便使用，为伤口愈合的佳品。

技术领域

本发明涉及一种用于伤口愈合精华液的制备方法，特别涉及一种脐带间充质干细胞伤口愈合因子精华液的制备方法。

背景技术

伤口愈合是一个涉及多种类型细胞的复杂过程，正常情况下伤口的修复过程包括三个阶段，炎症期、肉芽组织形成期、组织改造塑型期，在这一过程中有一系列已知的细胞因子和生物化学反应发生，大量研究表明细胞因子在伤口愈合的各个阶段均发挥着重要的作用，他们通过介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质的相互作用，参与组织修复、更新和再生，已有研究指出通过添加外源性细胞因子，可以有效改善伤口愈合状况，具有重要的临床意义。

研究表明表皮生长因子（EGF）能够促进，加速核酸代谢，加快细胞从G-GI期转化，促进细胞的有丝分裂，促进表皮细胞增殖，从而促进伤口愈合。

转化生长因子β1能促进表皮细胞移动，趋化巨噬细胞和纤维母细胞，促进细胞外基质合成和塑形，与疤痕形成有重要关系。

白介素6可促进角质细胞迁移和瘢痕组织形成，白介素8有加速角质细胞增殖和上皮组织再生的能力，在炎症反应中均发挥重要作用。

很多精细的化工产品多含有乙醇、着色剂、铅汞等对人体肌肤有还得物质，消费者在使用过程中对身体是有害的，严重可能造成皮炎及感染问题，并且都不具有生物活性，不能从根本上改善皮肤的新陈代谢和生存环境,更不能达到伤口快速愈合的目的。

干细胞分泌因子中含有各种生理作用极强的生长因子，其作用备受瞩目，由于其在伤口愈合过程中发挥着重要作用，其有望在皮肤、角膜、消化道伤口的愈合中发挥重要作用，并且可以用于美容业中纹眉、美瞳线后的的皮肤修复，市场前景广阔。

发明内容

本发明提供了一种分离间充质干细胞分泌因子的方法，它包括如下步骤。

（1）脐带组织选取：选取1个健康产妇正常分娩或者剖腹产脐带组织，为孕妇自愿的前提下选取，2℃～8℃条件下保存，24小时内进行处理。

（2）分离并培养脐带间充质干细胞：根据步骤（1）中取得的脐带组织，在24小时内进行间充质干细胞的分离和培养，过程如下：将脐带组织置于百级超净台环境下的培养皿中，用PBS将组织表面的血迹冲洗干净，将脐带组织剪成小段，并将脐带内血管以及脐带表面羊膜组织去除，剩余的部分用镊子和手术刀分离开，将组织块转移到T175的培养瓶中，加入脐带间充质干细胞专用培养基，37℃、5%CO₂培养箱中进行培养。

（3）获取P2代细胞：经过对步骤（2）中的组织进行培养，观察脐带间充质干细胞的生长状态，发现每块组织都有细胞爬出时将培养瓶中的组织块取出，继续培养，当汇合度达到90%左右的时候胰蛋白酶消化，获取P1代细胞；P1代细胞转移到T175的培养瓶中继续培养，当回合度达到90%左右时胰蛋白酶消化，获得P2代细胞。