[发明专利]低表达GFPT1的DU145稳定细胞株及构建与应用

权利要求书

1.一种DU145-shGFPT1稳转细胞系的应用，其特征在于，将GFPT1的低表达调控AMPK的磷酸化；包括以下步骤：

1）将GFPT1低表达细胞（0.5-1.5）×10⁶细胞/皿的数量接种到培养皿中，

2）12-24小时后，在培养基 中加入终浓度10-50mM的2-DG即2-deoxy-D-glucose，继续培养1-24小时，

3）吸走培养基，加入1-2 ml PBS洗去剩余培养基，吸走PBS，将细胞培养皿置于液氮中淬灭；

4）每个培养皿加入100-200 μl的RIPA裂解液，破碎细胞，提取蛋白；

5）对蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转印至0.22μm的PVDF膜上；

6）利用β-actin，AMPKα，ACC，p-ACC S79特异抗体，通过Western Blot进行化学发光；

所述DU145-shGFPT1稳转细胞系的构建方法为：以前列腺癌DU145细胞作为宿主细胞，通过慢病毒感染导致细胞中GFPT1蛋白的表达量下调来抑制肿瘤细胞的生长。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DU145-shGFPT1稳转细胞系的构建包括以下步骤：

1) 用于慢病毒包装的细胞293T接种于细胞培养皿60mm；

2) 在293T细胞中以1:8:9的质量比例转染5μg包装质粒及病毒质粒，质粒分别为pVSVg :PSPAX2 : shRNA，shRNA包含shControl及shGFPT1片段，shGFPT1片段1（sh1）的序列：GCTATGACTTCGAATCTGA；shGFPT1片段2（sh2）的序列：AGGCAAAGACAAGAAAGGA；

3) 转染8-12h后吸去培养基并加入完全培养基；

4) 转染后48-72h，将上清放入离心管中，3000-4000转离心10-15分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒；

5) 感染前16-24h将靶细胞DU145/VCAP接种于细胞培养皿以使第二天细胞密度达到50%-60%，取1-2ml病毒液加入5-6μg/ml polybrene后加入到预感染的DU145/VCAP细胞中；

6) 感染的DU145/VCAP细胞培养8h~24h后吸去培养基，换用完全培养基转至10cm dish中，继续培养；

7) 用含1.5-2μg/ml puromycin的培养基换液对细胞进行筛选。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述DU145-shGFPT1稳转细胞系的构建还包括以下步骤：

8）通过免疫荧光及免疫共沉淀技术检测GFPT1的感染效率及表达量的变化；

9) 十二孔板中接种3000个DU145低表达GFPT1细胞，在第3、5、7、9天取出细胞进行结晶紫染色，拍照后用冰醋酸洗涤细胞，用酶标仪读取数值,绘制细胞的增殖曲线。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过干扰GFPT1来促进AMPK的磷酸化，能够抑制前列腺癌细胞的增殖。