[发明专利]低表达GFPT1的DU145稳定细胞株及构建与应用

说明书

本发明公开一种新发现的可以对前列腺癌增殖产生影响的通路‑GFPT1调控AMPK磷酸化的通路。具体采用shRNA干扰技术在DU145细胞中干涉GFPT1，以达到激活AMPK的活性，抑制细胞增殖的目的，经过结晶紫染色和蛋白免疫印迹实验检测证实，GFPT1的抑制能够激活AMPK通路抑制细胞增殖，从而达到有效治疗前列腺癌的目的。

技术领域

本发明涉及到细胞生物学与生物化学与分子生物学技术，具体涉及检测细胞增殖及AMPK磷酸化的方法。

背景技术

肿瘤的发生发展常常与一系列能量产生机制的失衡相关。从正常细胞到肿瘤细胞的进化过程中,细胞必须面对各种各样的胁迫,例如癌基因的激活、低氧条件、营养物质的缺乏及化学和放射治疗。在压力的刺激下肿瘤细胞通过调节细胞代谢以提供支持肿瘤生存和成长的营养。将细胞代谢和肿瘤联系在一起最有代表性的分子之一是AMP活化的蛋白质激酶AMPK(AMP-activated protein kinase,AMPK)。

肿瘤代谢紊乱是肿瘤发生发展的重要特征，肿瘤的生长常常与一系列的能量产生机制的失衡相关，这种现象被称为Warburg现象。即肿瘤细胞主要使用糖酵解及乳酸发酵产生能量，而不是通过三羧酸循环中丙酮酸的氧化磷酸化。葡萄糖是生物体内主要的营养物质,在被细胞摄入后就迅速的被磷酸化生成6-磷酸葡萄糖,进一步转换成6-磷酸果糖。大部分的6-磷酸果糖通过糖酵解作用产生ATP，2％-5％的葡萄糖进入己糖胺信号通路(HBP)。与正常细胞相比肿瘤细胞葡萄糖的吸收及糖酵解明显增加,导致了糖酵解中间途径HBP和磷酸戊糖途径(PPP)的增加。

GFPT1作为己糖胺合成中的第一个及限速酶,在癌症中的作用这些年受到了越来越多的关注。通过数据库分析，GFPT1在乳腺癌、前列腺、肺癌、膀胱癌、胰腺癌等许多恶性肿瘤中异常表达，证明GFPT1在肿瘤发生发展中具有重要作用。同时研究证实GFPT1高表达的三阴性乳腺癌患者的存活期及总生存数明显下降。前列腺癌病人的组织中GFPT1表达量明显升高,研究者认为GFPT1可作为前列腺癌的标签蛋白。

发明内容

本发明涉及辅助治疗前列腺癌的新通路，目的一是阐明GFPT1通过调节AMPK的磷酸化抑制肿瘤发生发展，目的二,为GFPT1在癌症诊断、预后、治疗、肿瘤标志物筛选等临床转化应用提供基础。

实验结果表明，GFPT1抑制了肿瘤细胞的生物合成，同时在2-DG处理条件下，GFPT1抑制了AMPK的磷酸化。包括如下步骤：

包装细胞的转染

1)转染前一天将慢病毒包装细胞293T接种于60mm细胞培养皿以使第二天细胞密度达到60％～70％。

2)在293T细胞中以1:8:9的比例转染5μg包装质粒及病毒质粒分别为pVSVg:PSPAX2:shRNA(包含shControl及shGFPT1片段)。

3)转染8-12h后吸去培养基并加入3ml完全培养基。

4)转染后72h，将上清放入15ml离心管中，3000转离心10分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒(后续实验凡是接触过病毒液的吸管都要用84消毒液清洗)。

靶细胞感染与筛选

1)感染前24h将靶细胞DU145接种于35mm dish或六孔板中以使第二天细胞密度达到50％左右。

2)取1ml病毒液加入5μg/ml polybrene后加入到预感染的DU145/VCAP细胞中，并于37℃、5％CO2培养箱内培养。

3)感染的DU145细胞培养8h～24h后吸去培养基，换用完全培养基转至10cm dish中，继续培养。

4)24h后用含1.5μg/ml puromycin的培养基换液，等细胞长成后验证目标基因的表达。