[发明专利]一种固定化漆酶及其制备方法

说明书

本发明公开了一种固定化漆酶及其制备方法，该固定化漆酶是以高岭土为载体，漆酶通过物理吸附作用固定于高岭土上。其制备方法为将高岭土与漆酶溶液混合进行振荡吸附，离心，得到固定化漆酶。经优化得到的最佳固定化条件：固定化时间为15min、pH为5.0、漆酶初始浓度为0.8mg/mL。本发明的固定化漆酶具有热稳定性好、酶吸附量大、酶活力强、环境友好、对孔雀石绿/Cd2+去除效果好等优点，其制备方法具有操作简便、易于控制、制备成本低、适合大规模制备等优点。

技术领域

本发明涉及漆酶的固定化领域，具体涉及一种固定化漆酶及其制备方法。

背景技术

漆酶（Laccase，EC 1.10.3.2）是一种苯二酚-氧化还原酶，属于蓝多铜氧化酶（Blue multi-copper oxidases，BMCOs）家族。漆酶分布比较广泛，在真菌、昆虫、细菌、藻类及其高等植物中均有发现，是一种催化底物范围广，催化效率高的绿色环保生物催化剂。目前，漆酶在环境污染物降解、木质素纤维改性、生物传感器制造业、纺织业等应用价值显著。但由于漆酶稳定性差、易失活、在使用过程中容易因为环境的变化而变形失活，且不易从反映体系中分离，产物的分离纯化比较复杂，随着反应时间的延长，反应速率也会逐渐下降，因此，漆酶的工业化应用在一定程度上受到了限制。固定化酶技术是克服了自由酶的上述不足，实现漆酶的连续使用和改善其稳定性的有效手段。固定化酶是指利用物理或化学的手段将酶固定在载体上或束缚在特定区域内，仍能保持原有催化特性，并可回收及循环使用的一类技术。

漆酶的固定化方法包括包埋法和化学法等，其中包埋法容易发生化学聚合反应，导致酶活力损失，并且该方法要求底物和产物是可以通过高分子凝胶的网格扩散的小分子，限制了大分子的酶和底物的应用等。而化学法固定化方法的缺点是载体需要活化剂提前处理；固定化操作比较复杂；反应条件比较强烈；化学修饰时易造成酶失活；蛋白质通过氨基酸侧链功能基团参加共价连接往往会引起酶分子的结构变化从而导致活力降低，需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。固定化酶中常用的固定化载体包括活性炭、海藻酸钠、介孔材料以及微滤膜等，但现有的固定化材料存在固定化效率低、加工工艺复杂、成本高等缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种廉价的粘土矿物高岭土固定的且具有优异酶学性能的固定化漆酶，以及相应提供该固定化漆酶的制备方法。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：一种固定化漆酶及其制备方法，其特征在于，所述固定化漆酶是由高岭土固定化漆酶制备得到；所述漆酶来自云芝，≥0.5units/mg；所述固定化漆酶的最适pH为4.5，最适温度为40℃；所述固定化漆酶制备方法包括以下步骤。

（1）先将高岭土置于100℃-120℃的条件下干燥4h-8h。

（2）将上述干燥好的高岭土与漆酶溶液进行混合，所述漆酶溶液中的初始漆酶浓度为0.05mg/mL~2.0mg/mL，所述漆酶溶液的pH值为3.0~7.0；然后将高岭土加入至所述漆酶溶液中，在25℃~35℃的温度下、150rpm~300rpm转速下对所述漆酶和高领土混合溶液振荡15min~300min。

（3）将（2）中所得的固定化酶经过对应pH的缓冲溶液洗涤、5000rpm~10000rpm转速离心分离、-100℃下冷冻和真空干燥20h~24h后即可。

上述的制备方法中，优选地，所述高岭土置于120℃的条件下干燥6h。

上述的制备方法中，优选地，所述高岭土与漆酶的混合液中高岭土与漆酶的质量配比为1：（1~6）。

上述的制备方法中，优选地，所述步骤（2）中，所述漆酶溶液是由漆酶与柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液配制而成，所述柠檬酸缓冲液的pH值为3.0~6.0，所述磷酸缓冲液的pH值为7.0。