[发明专利]用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物、检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物、检测方法及试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)为圆环病毒科圆环病毒属的一种小而无囊膜、二十面体对称、环状、共价闭合的单股DNA病毒。病毒粒子直径平均为17nm，以滚环方式进行复制，是目前发现的最小的无囊膜DNA病毒。Brain、Allan等认为可根据猪圆环病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列可将猪圆环病毒分成两种基因型，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1于1974年首次在PK细胞培养物中作为一种污染物鉴定，其对猪只没有致病性。PCV2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated diseases，PCVAD)，主要引起仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道综合征(PRDC)、母猪繁殖障碍症、增生性肠炎、坏死性间质性肺炎、仔猪先天性震颤等，表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。近来，一种新型的猪圆环病毒3型病毒在美国首次被报道，该病毒基因组全长2.0kb，其基因编码两个主要蛋白：Cap蛋白和Rep蛋白，两者在核酸链上处于相反方向，其能引起猪皮炎肾病综合征、繁殖障碍、心脏和多系统炎症等症状。

目前检测PCV的常用检测方法主要有病毒分离、血清学检测以及PCR检测等。但病毒分离、血清学检测方法费时费力、敏感性低且容易出现假阳性。而PCR检测的方法主要以某一病毒类型的单一检测为主，不能进行多种病毒类型的联合PCR检测，并且检测灵敏性与特异性也参差不齐。

由于PCV2和PCV3能引发猪圆环病毒相关疾病，若能建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的PCV2和PCV3联合检测鉴别方法，准确认别猪感染的病因并对症下药，对生猪养殖行业意义重大。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物、检测方法及试剂盒，建立一种能够同时鉴别诊断PCV2和PCV3病毒的双重PCR检测方法，且具有很高检测灵敏性与特异性，能够精准的鉴别诊断出猪感染的病因，从而实施正确的治疗方案，挽回经济损失。

本发明第一方面提供一种用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物，所述引物根据检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的高度保守的特异性序列设计双重PCR引物，其中，猪圆环病毒2型的检测引物，由SEQID NO：3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的反向引物组成，检测猪圆环病毒3型的检测引物，由SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列的反向引物组成。

上述的检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR引物在制备检测猪圆环病毒的制品中的应用。本发明第二方面提供一种用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR检测方法，包括以下步骤：

1)从待检样品制备基因组总DNA；

2)以制备的基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的双重PCR引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物；

3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。

在本发明一实施例中，所述用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR反应体系总体积为50μl，包括：

1)10μM的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：11、SEQID NO：12所示核苷酸序列各1μl；

2)10×ExPCR Bμffer 5.0μl；

3)dNTP Mixtμre 4.0μl；

4)ExTaq DNA聚合酶1.0μl；

5)RNase free ddH₂0 32.0μl；

6)待测样品的DNA模板4μl。

在本发明一实施例中，所述用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR反应条件包括：94℃预变性4min后进入循环；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环结束后；72℃终延伸10min。

在本发明一实施例中，所述的用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重PCR检测方法，其检测灵敏度可达10²拷贝/μL。