[发明专利]检测MSI的非诊断方法

说明书

本发明公开检测MSI的非诊断方法。从血液分离血浆和白细胞，并提取血浆中的ctDNA，和白细胞中的gDNA；分别以ctDNA和gDNA为模板建立测序文库和标准文库并测序；在测序文库和标准文库中分别确定各位点中重复单元的序列，并分别统计各序列长度，计算各序列长度的相对频率分布，去除序列长度等于300bp及测序文库与标准文库共有的序列长度的相对频率，以各位点在测序文库和标准文库中的相对频率绘制分布曲线，根据两条曲线是否趋势一致判断是否存在MSI。本发明的方法能够有效检测血液中肿瘤细胞的微卫星不稳定状态，而不依赖于肿瘤组织，从而减轻患者取样时的痛苦，检测方便快捷。

技术领域

本发明通常涉及基因检测领域，特别地涉及微卫星重复序列长度改变的检测方法。

背景技术

微卫星(MS)为广泛分布于原核及有核细胞生物且由1-6个核苷酸组成的，具有高度多态性的简单串联重复序列。尽管MS在个体之间存在高度的多态性，但在个体内部保持一定的遗传稳定性(孟德尔共显性遗传)，因此，MS是重要的一类遗传标记，可以用于遗传性疾病的连锁分析和基因诊断。位于编码区的MS易于出现复制滑脱(比一般编码区中其他基因的发生概率高10～100倍)，当突变、缺失或者表观沉默导致错配修复(MMR)基因失去功能，从而不能修复DNA复制过程中滑动链与互补碱基出现的错配，导致一个或几个重复的碱基插入或缺失，进而产生MSI表型。

目前临床主要采用多重荧光PCR结合毛细管电泳进行MSI检测，通过扩增正常组织和肿瘤组织DNA，将等位基因谱进行比较分析，如果肿瘤样本DNA的等位基因出现异常的分型，表明存在微卫星不稳定，但是该技术存在的问题如下：(1)检测时要求必须同时制备肿瘤组织或正常组织(如，癌旁组织)，虽然检测结果准确，但是肿瘤组织需要手术或者活检取材，给患者创伤较大，如果部分患者因身体或其它原因无法进行手术或穿刺，这就造成患者无法完成检测。(2)肿瘤具有异质性，如果取材不当，可能导致检测假阴性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测MSI的非诊断方法，可以不依赖于肿瘤组织，只抽取患者血液即可完成检测。具体地，本发明包括以下内容。

一种检测MSI的非诊断方法，其包括以下步骤：

(1)样品制备步骤：从血液分离血浆和白细胞，并提取血浆中的ctDNA作为待检测样品，和白细胞中的gDNA作为标准样品，其中ctDNA经过agilent 2100生物分析仪检测，确保其中gDNA含量低于ctDNA的1/3。

(2)文库构建步骤：以所述ctDNA为模板建立测序文库，同时以所述gDNA为模板建立标准文库，其中各文库建立时用于PCR扩增的引物组由SEQ ID NO:1-14组成；

(3)文库测序步骤：以相同的方法分别对测序文库和标准文库进行测序；

(4)测序结果的分析步骤，其中包括在测序文库和标准文库中分别确定各位点中重复单元的序列，并分别统计各序列长度，计算各序列长度的相对频率分布，去除序列长度等于300bp及测序文库与标准文库共有的序列长度的相对频率，以各位点在测序文库和标准文库中的相对频率绘制分布曲线，并根据两条曲线是否趋势一致判断是否存在MSI。

根据本发明的方法，优选地，在样品制备步骤中，使用基于生物芯片的技术进行片段分析来确保gDNA的含量低于所述ctDNA的1/3。

根据本发明的方法，优选地，所述引物组包括位点引物和性别引物。

根据本发明的方法，优选地，文库构建包括使用SEQ ID NO:1-14组成的引物组进行多重PCR扩增，纯化扩增产物，并将纯化产物使用非PCR(PCR-Free)方式(包括末端修复、加A和接头连接)进行文库构建。