[发明专利]一种通过PCR技术判定土豆是否辐照的方法

权利要求书

1.一种鉴定待测土豆样本DNA损伤是否符合辐照特征的方法，其特征在于：所述方法包括下述步骤：

A、提取样本总DNA：

取同一批次的未辐照土豆样本、同一批次待检土豆样本至少各三个，分别提取每个样本的总DNA；

B、获取未辐照土豆样本总DNA中待检测核酸片段之间分布数量的相对倍数的对数的平均数：

将步骤A中提取的每个未辐照土豆样本总DNA采用引物对组合进行实时定量PCR检测，通过Livak分析，分别得到至少3个未辐照样本土豆总DNA中待检测片段之间分布数量的相对倍数的对数，并计算得到未辐照土豆样本总DNA中待检测核酸片段之间分布数量的相对倍数的对数的平均数；

所述引物对组合如下：

P1-P2引物对组合，其序列为：

P1：5’ATTCGGCCTAGCTCTGTGAC 3’，5’TGAGATGCCCAACTGCATGA 3’；

P2：5’AACGATGAGTGTTCGCCCTT 3’，5’GGCAATCTTTCCGGATTCGC 3’；

P3-P4引物对组合，其序列为：

P3：5’AGCACTACCGGTGGAAGGTA 3’，5’TTAGCCAAAGGTCGCTTGGA 3’；

P4：5’ACGGGAAATTGTCCGCGATA 3’，5’AAAATCAGGCAACGGTCCCA 3’；

C、获取鉴定方法检出限；所述鉴定方法检出限为空白标准偏差的3倍；

D、按照步骤B获取待检土豆样本总DNA中待检测核酸片段之间分布数量的相对倍数的对数；

E、鉴定待测土豆样本DNA损伤是否符合辐照特征：

当采用P1-P2引物对组合、P3-P4引物对组合中任意一组或2组获得的待检土豆样本待检测片段分布数量的相对倍数的对数与未辐照土豆对应组合的相对倍数的对数的平均数的差的绝对值大于空白标准偏差的3倍时，待检土豆样本DNA损伤不符合辐照特征；

当采用P1-P2引物对组合和P3-P4引物对组合获得的待检土豆的两个相对倍数值的对数与未辐照土豆对应组合的相对倍数的对数的平均数的差的绝对值同时小于等于空白标准偏差的3倍，待测土豆样本DNA损伤符合辐照特征；

所述土豆样本DNA损伤由加热、冻融或辐照造成的；

其中，所述土豆总DNA中待检测核酸片段之间分布数量的相对倍数等于：以2为底，以引物对组合中的两对引物定量PCR得到的初始循环数的差的绝对值为指数的指数函数值；

所述对数是以2为底的对数函数；

在步骤C中，所述空白标准偏差是指PCR鉴定方法的空白标准偏差，获取空白标准偏差是按照步骤B操作，以未辐照土豆总DNA为模板，采用所述引物对组合中的任意一对引物 进行至少20个相同的实时定量PCR反应，计算初始循环数结果的标准偏差，得到空白标准偏差。

2.根据权利要求1所述的鉴定待测土豆样本DNA损伤是否符合辐照特征的方法，其特征在于：所 述提取样本总DNA的方法是将样本液氮处理并碾磨土豆组织，然后使用乙醇沉淀或吸附柱 回收，总DNA溶于纯水或PE缓冲液后，50-65℃金属浴或水浴10min，去除残留乙醇得到样本 总DNA。

3.根据权利要求1所述的鉴定待测土豆样本DNA损伤是否符合辐照特征的方法，其特征在于：所述实时定量PCR的反应体系为10或20μL/管，PCR程序为预变性95.0℃2min，变性95.0℃5s，复性延伸60.0℃30s，40次重复，再次变性95.0℃5s，溶解曲线温度范围65℃-95℃，升温速度 0.5℃/5s。