[发明专利]一种动物精子活动度测定前的预处理方法及其应用

说明书

本发明公开了一种动物精子活动度测定前的预处理方法及其应用。所述预处理方法包括以下步骤：(1)迅速取死亡动物的附睾尾部置于(37±1)℃、pH为6.8～7.0的精子孵育液中；所述精子孵育液为含0.3～0.7％牛血清蛋白的无血清培养液，所述百分比为质量体积百分比；(2)将所述附睾尾部剪碎，于所述精子孵育液中恒温孵育2～5分钟后混匀，得精子悬浮液。本发明通过优化精子孵育液的配方、pH以及对精子孵育的时间，使得精子活动度检测更加快速、准确，并且测定的重复性好。

技术领域

本发明涉及精子检测领域，具体涉及一种动物精子活动度测定前的预处理方法及其应用。

背景技术

近年来，随着雄性生殖毒理研究的深入，提出了以精子形态结构和精子运动能力等作为雄性生殖功能影响重要观察指标。精子的运动能力是精子结构变化和功能状况的综合体现，是完成受精过程的基础，在雄性生殖毒理学研究中都把其作为衡量精液质量的主要指标之一。精子运动功能参数中，精子活力下降会导致生育率下降。因此，精子的运动能力可作为男(雄)性生殖毒性评价的早期敏感指标。精子活力测定方法的优化对雄性生殖毒理学研究有十分重要的意义。

影响精子代谢和生活力的因素很多，防止有害因素，正确利用有利因素,使精子保存在合适的环境之中，延长其保存时间十分关键。影响精子运动和存活时间的重要因素是温度、渗透压和pH。37℃～38℃是保持精子正常运动的适宜温度，随着温度的逐渐升高，精子的活动能力和代谢作用逐渐加强，能量消耗逐渐加快，存活时间开始缩短。例如温度超过50℃时，精子在5min之内就会不可逆地丧失活动力，而且大多数细胞能够被刚果红染色；在室温20℃和体温37℃之间，精子活动力的差异十分明显，因此，在恒温条件下评定精液的品质，就显得就十分重要了。渗透压也是影响精子在体外活动度的重要因素，精子只有在等渗溶液中才能保持正常的形态和生活力。在低渗溶液中水分通过细胞膜进入精子细胞内，使精子膨胀，尾部发生环状或者半圆形弯曲，摇摆运动，很快死亡。在高渗溶液中精子内水分向外弥散，精子皱缩，尾部发生锯齿状弯曲，运动缓慢，最后死亡。因此，在精液稀释时，配置等渗的精子稀释液十分关键，所用稀释液都是等渗的(通常情况下，精液是与6.9％的葡萄糖溶液等渗的)，配置剂量要准确，操作时防止精液与水接触。如上所述，精子在体外的活动度受到多种因素的影响，在保存和稀释精液时，特别要考虑到精液的酸碱度，然而目前在本领域内适于精子体外孵育的pH值的范围目前并没有统一的标准。

发明内容

本发明为克服现有技术当中精子活动度测定的方法耗时长、准确性低且重复性不好的缺陷，提供一种动物精子活动度测定前的预处理方法及其应用。所述预处理方法通过优化精子孵育液的配方、pH以及对精子孵育的时间，使得精子活动度检测更加快速、准确，并且测定的重复性好。

本发明提供一种动物精子活动度测定前的预处理方法，其包括以下步骤：

(1)迅速取死亡动物的附睾尾部置于(37±1)℃、pH为6.8～7.0的精子孵育液中；所述精子孵育液为含0.3～0.7％牛血清蛋白的无血清培养液，所述百分比为质量体积百分比；

(2)将所述附睾尾部剪碎，于所述精子孵育液中恒温孵育2～5分钟后混匀，得精子悬浮液。若所述恒温孵育时间小于2分钟精子不能充分游离出来，若大于5分钟则精子活力下降。

其中，步骤(1)中所述的无血清培养液可为本领域常规的无血清培养液，较佳地为RPMI1640或者DMEM。根据本发明，RPMI1640和DMEM均含有细胞培养所需要的基本培养成分，同样适于本发明中精子的孵育。

步骤(1)中所述的精子孵育液较佳地为含0.5％牛血清蛋白的无血清培养液，所述百分比为质量体积百分比。当所述精子孵育液中所含牛血清蛋白的质量体积百分比低于0.3％或者高于0.7％时，牛血清蛋白不能起到生理和机械保护作用以及载体作用。

步骤(2)中所述恒温孵育的时间不超过3分钟。