[发明专利]用于二代测序质量评估的文库、试剂及应用

说明书

本申请公开了一种用于二代测序质量评估的文库、试剂及应用。本申请的文库为具有不同碱基特征的已知序列的单链DNA文库，在文库中连接有接头序列和索引序列；单链DNA文库包括高AT含量单链DNA、高GC含量单链DNA、poly结构单链DNA和发夹结构单链DNA中的至少一种。本申请文库，采用具有不同碱基特征的已知序列测序，可评估不同碱基特征对测序的影响和偏差，实现测序质量评估，纠正这些偏差，实现测序优化。本申请提高核酸测序准确性的方法，通过比较测序结果和已知序列，获得不同碱基特征的测序偏差，指导测序软件算法改善，提高测序准确性；本申请方法，能有效减少测序偏差，为提高测序准确性提供了一种简单有效的方法。

技术领域

本申请涉及核酸测序质量评估领域，特别是涉及一种用于二代测序质量评估的文库、试剂及应用。

背景技术

高通量测序技术是一项非常重要的技术，在生物学研究和临床应用中都具有至关重要的作用，特别是在精准医疗中的作用显得越来越重要。随着二代测序在精准医疗中的地位越来越重要，相应的对其测序准确度要求也逐步提高。目前二代测序的主流平台，例如illumina和proton，都能达到99.9％的准确率，但是测序读长的加长，以及碱基含量的复杂度等，都可能导致测序准确率的下降。为了更好的满足二代测序在精准医疗中的作用，有必要不断提升测序技术。

目前二代测序的基本流程包括，测序文库的构建，文库信号的放大，依靠测序酶将碱基信号转变为测序仪能够识别的光信号，最后通过计算机软件将光信号还原成碱基信息。

在上述测序基本流程中，有几个方面都容易引进测序错误，导致测序的准确率下降：(1)文库构建过程中，片段的打断可能导致碱基突变或缺失，PCR扩增可能引入错误的碱基配对；(2)文库的信号放大一般也是通过PCR来进行，同样的，酶的保真性问题也可能引入测序的错误；(3)将碱基信号转变成电信号的过程中，因为dNTP一般是带修饰的dNTP，测序酶为配合改造的dNTP也需要进行相应的改造，其保真性在一定程度上也会受到影响，从而导致测序的准确度降低；(4)最后数据分析软件将光信号转化为碱基信息的过程中，也可能因为荧光背景、杂质、信号弱等因素导致信号处理出错。

一般情况下，为了验证二代测序的准确率，会选用一代测序sanger测序法进行验证。但是此方法较麻烦，不利于用于在测序技术研发中，有针对性地改进测序过程中各个环节中导致的错误率。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于二代测序质量评估的文库、试剂及应用。

本申请的一面公开了用于二代测序质量评估的文库，该文库为具有不同碱基特征的已知序列的单链DNA文库，并且在文库中连接有接头序列和索引序列；其中，具有不同碱基特征的已知序列的单链DNA文库包括高AT含量单链DNA、高GC含量单链DNA、poly结构单链DNA和发夹结构单链DNA中的至少一种。

需要说明的是，在实际的未知序列的测序过程中，可能存在的各种影响测序准确性的碱基特征，例如高AT含量、高GC含量、poly结构和发夹结构等，本申请创造性的采用人工合成的方法，合成具有以上不同碱基特征的已知序列的单链DNA文库；这样通过比较测序结果和已知序列，就可以获知所采用的测序平台具体会出现怎样的测序偏差，从而对二代测序质量进行评估。通过对这些测序偏差，还可以进一步的针对性的进行纠正，进而提高测序准确性。

可以理解，本申请用于二代测序质量评估的文库，除了可以进行二代测序质量评估以外，如前面所说的，还可以进一步的对二代测序进行纠正、优化，以提高测序准确性或测序质量。

还需要说明的是，为了使用方便，也为了进一步的减少建库流程，减少建库流程所引入的碱基错误或误差，本申请优选的，在文库中事先连接好接头序列和索引序列，也就是说，在合成文库的序列时，接头序列和索引序列是直接一起人工合成的；这就避免了再向文库添加接头序列和索引序列的反应步骤。其中，接头序列和索引序列的具体序列可以参考现有的测序平台，在此不做限定。