[发明专利]一种适用于长链非编码RNA构建及表达的整合型慢病毒载体系统及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种适用于长链非编码RNA构建及表达的整合型慢病毒载体系统及其应用。将系统中的慢病毒载体、pHelper 1.0载体和pCMV‑VSV‑G载体共同转染宿主细胞后，即可在宿主细胞中包装获得整合型慢病毒载体。本发明解决了常规慢病毒载体表达lncRNA带有冗余序列的问题，而且包装的病毒滴度高，能够提供高效的lncRNA转移、长期的基因表达，为lncRNA功能研究提供了一种更有效的方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种适用于长链非编码RNA构建及表达的整合型慢病毒载体系统及其应用。

背景技术

慢病毒作为一种特殊的逆转录病毒，与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗和转基因动物中载体研究的热点，并已经应用于多种疾病的基因治疗研究中。

典型的慢病毒载体系统为HIV-1载体系统，它由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，病毒基因组由5'LTR上游启动子转录，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。近些年，曾经被认为“转录垃圾”的非编码RNA得到井喷式地研究，研究表明，lncRNA在剂量补偿效应(Dosage compensationeffect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用。lncRNA本身不翻译蛋白质，依靠自身序列及结构特点发挥功能，lncRNA的作用机制非常复杂，至今尚未完全清楚。随着研究的推进，各类lncRNA的大量发现，lncRNA的研究作为RNA研究的新领域，已经成为一个非常吸引人的方向，有待广大科学家去探寻。

常规病毒载体出于包装容量的考虑，在单顺反子之间不会加入终止信号，所有顺反子共用一个终止子，这就导致了前端位置的基因转录产物包含后面的顺反子序列，这对编码基因而言影响不大，但对于lncRNA这类依赖序列及结构的基因而言，转录冗余序列有着不可忽视的影响。腺病毒，AAV这类DNA病毒可以在顺反子之间加入转录终止子，既不影响病毒包装又可实现精确的转录，但对于慢病毒载体而言，简单地加入终止子则会使5'LTR上游的启动子转录终止，从而造成病毒包装失败，正是基于这个原因，急需适合长链非编码RNA构建及表达的整合型慢病毒载体系统。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种适合长链非编码RNA构建及表达的整合型慢病毒载体及其应用，用于解决现有技术中的问题。

本发明的第一方面，提供一种适用于长链非编码RNA构建及表达的慢病毒载体，为慢病毒穿梭质粒，所述慢病毒穿梭质粒包括原核表达区和真核表达区，所述真核表达区包括位于5'LTR与3'LTR之间的目的基因表达框，所述目的基因表达框包括沿反义链5'-3'方向依次排列的启动子-MCS-转录终止子。

进一步地，所述转录终止子为poly(A)，所述poly(A)可选自多聚腺苷酸尾或或人工改造合成的特殊的poly(A)。

进一步地，所述poly(A)可以是Synthetic poly(A)，SV40late poly(A)，SV40early poly(A)，hGH poly(A)，bGH poly(A)等多聚腺苷酸尾(poly(A))。

进一步地，所述启动子选自广谱II型启动子或组织特异性启动子。

进一步地，启动子包含：Ubi，CMV，CAG，EF1α，EFS等广谱II型启动子以及GFAP，SYN等组织特异性启动子。