[发明专利]一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明涉及用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括以口蹄疫病毒3D基因为模板设计RPA引物、nfo探针，其中所述RPA引物包括FMDV‑nfo‑F和FMDV‑nfo‑R，所述nfo探针为FMDV‑nfo‑P；所述检测方法以口蹄疫病毒3D基因为靶基因，以O型口蹄疫病毒RNA为模板进行RT‑RPA扩增，在反应体系中加入M‑MLV反转录酶和RNA酶抑制剂，用侧流层析试纸条进行检测。本发明建立的RT‑RPA法可以在较大的温度范围内操作，扩增时间短，显色反应肉眼可见，能脱离对大型仪器、专业操作人员及正规实验室的依赖。

技术领域

本发明关于生物检测技术领域，尤其涉及一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)属于小RNA病毒科(picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，存在O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3 7个血清型，血清型间无交叉免疫现象。我国主要流行O型和A型，Asia 1型自2009年后未见临床病例报道。

对口蹄疫的早期预防和控制口蹄疫疫情传播所必须的重要手段。目前对口蹄疫病毒的检测主要依赖于分子检测方法，如RT-PCR和实时荧光RT-PCR，主要应用于装备良好的实验室，并需要配备精准昂贵的PCR设备和经过严格培训的技术人员，因此不适用于经济欠发达地区装备较差的实验室，更不适用于野外和现场检测。等温扩增方法不需要昂贵的精准扩增设备、连续的电力供应和复杂的样品处理，已经用于多种传染病包括动物疫病的快速检测，尤其是现场检测。近年来，针对口蹄疫病毒的系列等温检测方法主要包括反转录绝缘等温PCR(RT-iiPCR)、环介导等温扩增(RT-LAMP)、核酸序列依赖性扩增(NASBA)、解旋酶恒温扩增(RT-HDA)和重组酶聚合酶扩增(RPA)等。RT-iiPCR依赖于专门的检测设备(POCKITTM Analyser)，反应时间为60min；RT-LAMP需要6条引物，设计复杂，反应时间一般需要60min；NASBA和RT-HAD反应时间更长，分别需要90min和120min。上述等温检测方法反应时间较长，对检测结果的判定依赖于检测设备或琼脂糖凝胶电泳，因此，在野外现场应用时存在一定的限制，难以有效展开。RPA是一种操作简便、反应快速、特异性强、灵敏性高，并且成本较低的等温扩增技术，但现有技术中针对口蹄疫病毒建立的实时RT-RPA方法多依赖于昂贵的特异性荧光检测设备，不适用于经济欠发达地区装备较差的实验室，也不适用于野外现场的应用。如果样品需要在一定的冷链条件下运输到实验室检测，则需要较长的时间，从而造成检测结果的推迟，进而影响对发生的FMD疫情采取进一步的有效措施。

发明内容

针对现有技术中检测口蹄疫病毒所需反应时间长、需要使用昂贵设备进行检测、不适用于野外现场应用的技术问题，本发明提供了一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒，包括以口蹄疫病毒3D基因为模板设计RPA引物、nfo探针，扩增片段大小为258bp，其中所述RPA引物包括FMDV-nfo-F和FMDV-nfo-R，所述FMDV-nfo-F的序列为5′-3′TTGGTCACTCCATTACCGATGTCACTTTCCTC-3′，所述FMDV-nfo-R的序列为5′-Biotin-AACGCAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTGGAAT-3′；所述nfo探针为FMDV-nfo-P，所述FMDV-nfo-P的序列为5′-FAM-GCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGAT(THF)TCCGTGGCAGGACTCG-C3-spacer-3′。

该试剂盒中的引物和nfo探针对其他小RNA病毒扩增具有特异性，可以提高检测结果的准确性。