[发明专利]靶向RNA甲基化的RNA Cas9-m6A修饰载体系统及其构建方法和应用

权利要求书

1.靶向mRNA的6-甲基腺嘌呤修饰载体系统，其特征在于，所述载体系统包括失活的Cas9核酸酶融合6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区的蛋白的表达载体、靶向CDCP1的mRNA的3’UTR区中至少一个位点的sgRNA表达载体以及与作为标靶的mRNA错配的寡核苷酸；

所述失活的Cas9核酸酶融合6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区的蛋白的表达载体为pcDNA3.1-dcas9-2×NLS-METTL3 活性区域 -EGFP载体，所述pcDNA3.1-dcas9-2×NLS-METTL3 活性区域 -EGFP载体构成为：(a)dCas9-2×NLS序列如SEQ ID NO.1所示、(b)METTL3 活性区域 序列如SEQ ID NO.2所示、(c)EGFP序列如SEQ ID NO.3所示；

所述sgRNA表达载体靶向CDCP1的mRNA的3’UTR区155位点或173位点或212位点；所述sgRNA表达载体的序列分别对应如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；所述寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.14所示。

2.靶向mRNA的6-甲基腺嘌呤修饰载体系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)从载体pHR-SFFV-KRAB-dCas9-P2A-mCherry扩增出dCas9-2×NLS序列，从HUVEC细胞中扩增出METTL3酶活性区域序列，从载体pLKO.3G扩增出EGFP序列，通过PCR扩增、酶切、连接、转化，将dCas9-2×NLS序列，METTL3活性区域序列以及EGFP序列连接至pcDNA3.1V5HisTOPO载体，得到失活的Cas9核酸酶融合6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区的蛋白表达载体；所述dCas9-2×NLS序列如SEQ ID NO.1所示；所述METTL3 活性区域 序列如SEQ ID NO.2所示；所述EGFP序列如SEQ ID NO.3所示；

2)构建包括酶切位点序列和sgRNA支架序列的sgRNA支架结构；合成基于靶点序列的sgRNA；将所述sgRNA支架结构和基于靶点序列的sgRNA克隆至表达载体中，得到包括启动子序列、基于靶点序列的sgRNA、sgRNA支架序列和酶切位点序列的表达载体，所述基于靶点序列的sgRNA分别如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；

3)合成基于靶点序列、并与作为标靶的mRNA错配的寡核苷酸，所述寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.14所示；

所述靶向mRNA的6-甲基腺嘌呤修饰载体系统包括所述失活的Cas9核酸酶融合6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区的蛋白表达载体、所述寡核苷酸以及所述包括启动子序列、基于靶点序列的sgRNA、sgRNA支架序列和酶切位点序列的表达载体。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的表达载体为pBlueScript II SK(-)质粒或Lentiguide-puro载体。

4.权利要求1所述的载体系统在制备治疗RNA修饰异常引起的疾病的药物中的应用。

5.一种治疗RNA修饰异常引起的疾病的药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1所述的载体系统。