[发明专利]靶向RNA甲基化的RNA Cas9-m6A修饰载体系统及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种靶向mRNA的6‑甲基腺嘌呤修饰载体系统，所述载体系统包括失活的Cas9核酸酶融合6‑甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区的蛋白表达载体、靶向CDCP1的mRNA的3’UTR区中至少一个位点的sgRNA表达载体以及与作为标靶的mRNA错配的寡核苷酸。同时，本发明还公开了靶向mRNA的6‑甲基腺嘌呤修饰载体系统的制备方法及其应用。采用本发明的6‑甲基腺嘌呤修饰载体系统，可以对RNA 6‑甲基腺嘌呤修饰异常引起的疾病进行靶向修饰6‑甲基腺嘌呤，准确而高效，可以从根本上治疗RNA修饰缺陷引起的疾病。

技术领域

本发明涉及RNA编辑技术领域，尤其是靶向RNA甲基化的RNA Cas9-m6A修饰载体系统及其构建方法和应用。

背景技术

腺嘌呤6-甲基化(即m6A)是mRNA和长链非编码RNA中最为常见的修饰，研究证实m6A修饰发生在细胞核内，由甲基转移酶METTL3、METTL14、结合亚基WTAP及RBM15(m6A‘Writer’，m6A编码器)和去甲基转移酶FTO、ALKBH5(m6A‘Eraser’，m6A消码器)动态催化调节。m6A可以通过结合YTH结构域蛋白(m6A‘Writer’，m6A读码器)发挥其生物学作用。

CDCP1是一种重要的跨膜蛋白，由836个氨基酸组成，包括一个含29个氨基酸残基的氨基端信号肤及分别由636、21、150个氨基酸组成的胞外段、跨膜段和胞内段。研究证实CDCP1作为Src、EGFR、HER2等信号通路的关键节点在多种肿瘤发生发展中起重要作用。我们前期研究发现促癌基因CDCP1的3'UTR存在m6A甲基化修饰。

靶向RNA Cas9(RCas9)技术是Doudna实验室首先研究报道的，其作用原理是除设计sgRNA外，还通过提供包含PAM与靶RNA杂交的寡核苷酸(PAMmer)，利用依赖于PAM序列的Cas9靶向mRNA机制，在PAMmer/RNA杂交中存在错配的PAM序列，使得Cas9特异靶向RNA而不是基因组DNA(如图14所示)。Doudna实验室研究发现Cas9在PAMmer和sgRNA介导下在体外强烈和特异性结合和随后切割ssRNA。新近的研究揭示将dCas9(Cas9活性位点经过两个不同位置的定点突变：D10A、H841A，而丧失核酸内切酶活性)特异靶向mRNA，即通过RCas9技术可识别内源性mRNA，并能用于靶向的mRNA示踪。

发明内容

基于上述背景技术，为了寻找治疗RNA修饰异常引起的疾病的新思路，我们首次将m6A修饰酶的酶活性功能域连接到dCas9的C端，通过设计PAMmer和sgRNA，将其特异靶向mRNA上，从而对特异位点进行m6A修饰(如图15所示)；我们通过工程RNA修饰酶特异靶向底物以改变RNA修饰这一策略，为RNA修饰异常引起的人类疾病防治提供了新的途径。应当说明的是，此处的RNA修饰异常包括5-甲基胞嘧啶修饰，1-甲基腺嘌呤修饰等。

作为本发明的第一个方面，本发明提供了靶向mRNA的6-甲基腺嘌呤修饰载体系统，所述载体系统包括失活的Cas9核酸酶融合6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区的蛋白表达载体、靶向CDCP1的mRNA的3’UTR区中至少一个位点的sgRNA表达载体以及与作为标靶的mRNA错配的寡核苷酸。

应当说明的是，本文中的Cas9即核酸酶；3’UTR指信使RNA(mRNA)分子3’端的非编码片段；sgRNA指小向导RNA(small guide RNA)；此处的寡核苷酸指PAM序列(protospaceradjacent motifs)。其中，sgRNA表达载体可以靶向CDCP1的mRNA的3’UTR区中一个位点、两个位点、或者三个位点，甚至更多位点，可以根据需要进行选择。

优选地，所述6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区域对应的核苷酸序列与核酸酶失活的Cas9对应的核苷酸序列的C端连接，由此，表达的融合蛋白(即失活的Cas9核酸酶融合6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区对应的蛋白质)可在sgRNA以及PAMer的引导下对特定的RNA进行6-甲基腺嘌呤修饰。