[发明专利]一种多糖裂解单加氧酶编码基因及酶和制备与应用

说明书

本发明公开了一种来源于嗜热毁丝霉菌(Myceliophthora thermophila)的多糖裂解单加氧酶基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该多糖裂解单加氧酶的基因克隆到毕赤酵母表达载体上，获得可异源表达该酶的毕赤酵母重组菌株，该菌株异源表达制备的多糖裂解单加氧酶，能高效降解纤维素(氧化裂解β‑1,4‑糖苷键)。本发明提供的多糖裂解单加氧酶可广泛应用于能源、农业、食品、饲料添加剂、医药等领域。

技术领域

本发明涉及一种多糖裂解单加氧酶的基因序列及其酶的制备方法和应用。本发明提供了该多糖裂解单加氧酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在多糖降解方面的应用。本发明提供的多糖裂解单加氧酶可广泛应用于能源、农业、食品、饲料添加、医药等领域。

背景技术

植物细胞壁主要由多糖和木质素组成。在植物细胞壁的干重组成中，纤维素，半纤维素和木质素分别占20-50％，15-35％，和10-30％。其中，纤维素是自然界分布最广泛，含量最多的生物质来源，对纤维素的有效利用，能为人类社会提供大量的化学品与能源品。纤维素利用有多种方法，其中生物法具有环境友好、条件温和等优势，但生物法利用纤维素的一个瓶颈问题是酶降解效率低、成本高。这是因为纤维素具有生物质抗降解屏障。传统的纤维素酶系均属于糖苷水解酶家族，主要包括内切β-1,4-葡聚糖酶，纤维二糖水解酶和β-1,4-葡萄糖苷酶。糖苷水解酶对纤维素的结晶区降解困难，只能在纤维素的非结晶区降解，使得其在工业应用中成本较高，不利于生物质的转化利用。

2010年，研究人员发现了一类具有氧化活性的金属酶，可以通过氧化的方式裂解多糖中的糖苷键。这类多糖裂解单加氧酶(LPMO)是一类能够降解多糖的氧化酶，在电子供体和氧气存在的条件下，氧化裂解糖苷键，生成含氧化糖链末端的寡糖片段。LPMO能够和糖苷水解酶协同作用，提高难溶底物的降解效率。多糖裂解单加氧酶分为细菌和真菌两种来源，其中细菌来源的LPMO属于具有辅助活性的AA(Auxiliary Activity)10家族，主要降解几丁质，少部分可以降解纤维素；真菌来源的LPMO分为AA9，AA11和AA13家族，主要降解底物分别为纤维素、淀粉和几丁质。其中，AA9家族的LPMO底物降解纤维素中的β-1,4糖苷键，也对其它含有β-1,4-D-葡萄糖苷键的底物有一定的降解作用。AA9家族的LPMO也曾被分类为糖苷水解酶GH(Glycoside Hydrolase)61家族。AA9家族的LPMO按照氧化位点不同分为三类，PMO1s和PMO2s分别为C1位和C4位氧化，PMO3s为C1和C4同时氧化。AA9家族的LPMO具有高度的同源性，和相似的β三明治结构，其活性中心由二价铜离子和与之共轭的组氨酸环组成。

嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophile ATCC 42464，后更名为Thermothelomyces thermophila)具有较强的纤维素降解能力，在纤维素利用过程中有潜在应用价值。国际酶制剂巨头诺维信将嗜热毁丝霉作为提升纤维素降解能力的重要资源之一，利用大麦秸秆木质纤维素所谓底物，该公司发现将嗜热毁丝霉粗酶与纤维素酶连用可大幅提高降解能力。2011年，嗜热毁丝霉基因组被测序，使得对嗜热毁丝霉中多糖裂解单加氧酶的研究成为可能。目前，仅有三篇关于嗜热毁丝霉菌来源的LPMO的报道。2015年，发现MtLPMO9A对纤维素和木聚糖具有氧化活力，以及对纤维素酶的协同增效作用，但尚无相关机制研究。2016年，研究了底物和还原剂对嗜热毁丝霉来源的LPMO降解过程的影响，研究了其底物降解模式，并预测其结构。2017年，以MtPMO3为例，对LPMO中铜离子活性中心的次级共轭结构进行了研究。目前嗜热毁丝霉菌来源的多糖裂解单加氧酶主要为机制研究，对于酶学性质、纤维素以外的底物特异性、协同效果等研究较少。