[发明专利]一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法。

背景技术

日本鳗鲡（Anguilla japonica）是一种具有重要经济价值的降海产卵洄游性鱼类，广泛分布于中国、日本以及韩国。其生活史非常复杂，生长阶段经历了柳叶鳗、玻璃鳗、黄鳗、银鳗等阶段。由于近几十年来的人为影响及全球气候变化等，造成了其野生资源数量锐减，目前已处于濒危状态。尽管日本鳗鲡的分布范围非常广泛，几乎占据了整个亚洲东部沿海，但是其只存在马里亚纳群岛附近一个产卵场，所以一直以来被认为是一个随机交配物种的典型代表。然而，关于日本鳗鲡是否应作为单一的随机交配群体进行管理与保护是长期存在争议的科学难题。在以往的有关日本鳗鲡群体遗传学研究当中，由于标记数目的限制，往往不能够全面精确分析和揭示日本鳗鲡的群体遗传结构，所获结果并不一致，甚至互相矛盾。为合理保护与管理日本鳗鲡这一珍贵的海洋生物资源，非常有必要进一步开发更多广泛均匀分布于基因组水平上的遗传标记，开展日本鳗鲡的遗传多样性现状、种群遗传结构等方面的系统研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法，该方法克服了标记数目的匮乏对日本鳗鲡群体遗传结构精确分析的限制，且获取效率高，无需纯化步骤，降低了DNA片段的损失和浪费，减少了获取成本。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法，包括以下步骤：

提取基因组DNA：采用酚/氯仿抽提法从日本鳗鲡肌肉或鳍条组织中提取基因组DNA；

DNA模板的制备：采用限制性内切酶EcoRI对基因组DNA进行酶切，向酶切片段中加入第一接头，将所得DNA片段混池，打断，通过琼脂糖凝胶电泳回收200bp-400bp的DNA片段，末端平化后3’端加“A”，接着加入第二接头，得DNA模板，操作简便，无需纯化步骤，降低了DNA片段的损失和浪费，减少了获取成本；

高通量测序：通过桥式PCR扩增所制备的DNA模板，成簇后应用Illumina HiSeq4000测序平台进行双端测序，高通量测序不依赖于参考基因组信息，降低了基因组的复杂性并且成本较低。

作为优选，DNA模板的制备过程中酶切反应体系为50μL，其中含有2μL 10×NEB buffer，0.5μL内切酶，0.5μL基因组DNA，其余为双蒸水。该条件下，内切酶稳定性好，不易失活，且所获得的DNA片段纯度高，为后续步骤提供了充足的DNA片段。

作为优选，高通量测序过程中桥式PCR扩增所用的上游引物序列为：5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’，下游引物序列为：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。该引物能够与目的基因完全互补，使引物的延伸可以顺利进行，在确保复制准确性的同时大大提高了扩增的效率。

作为优选，高通量测序过程中桥式PCR扩增条件为：98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，进行18个循环，最后72℃延伸5min。该条件下，靶序列变性彻底，不影响聚合酶的活性，且降低了PCR反应后期底物的消耗和PCR抑制物的增加多PCR反应效率的影响。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明所公开的一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法克服了标记数目的匮乏对日本鳗鲡群体遗传结构精确分析的限制，且获取效率高，无需纯化步骤，降低了DNA片段的损失和浪费，减少了获取成本；所采用的酶切体系中内切酶稳定性好，不易失活，且所获得的DNA片段纯度高，为后续步骤提供了充足的DNA片段。

具体实施方式

以下结合实施例作进一步详细描述：

实施例1：一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法，包括以下步骤：