[发明专利]一种表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其应用

权利要求书

1.一种表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒，其特征在于该重组新城疫病毒是通过以下方法构建的：

1)取鸭细小病毒，利用RT-PCR方法扩增得到NDPV-VP3基因，回收PCR产物，连接至pMD18-T-Vector；

2)将NDPV-VP3基因与pLMV-RFP线性化载体相连接，并将连接产物转化至Stbl2感受态细胞，筛选出阳性克隆，即得到重组NDV病毒质粒；

3)将表达T7聚合酶的重组痘病毒vTF7-3以MOI＝3的滴度接种于单层BHK-21细胞的24孔板内，孵育1h后，将pLMV-VP3、pcDNA-NP、pcDNA-P及pcDNA-L质粒共转染BHK-21细胞，转染72h后，将收获拯救的重组病毒接种10日龄SPF鸡胚，收获HA、HI检测均为阳性的鸡胚尿囊液，即得到重组新城疫病毒rLMV-NDPV-VP3。

2.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒，其特征在于步骤1)中RT-PCR扩增的引物序列分别如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示。

3.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒，其特征在于步骤2)中所述将NDPV-VP3基因与pLMV-RFP线性化载体相连接，具体包括以下操作：

A)以含有PHY.LMV42全长cDNA的重组质粒pLMV-RFP为模板，利用引物在质粒pLMV-RFP的RFP ORF的两端通过反向PCR扩增得到含PHY.LMV42全长cDNA的线性化载体；

B)利用引物扩增NDPV-VP3基因，得到的基因末端含有与PHY.LMV42线性化载体末端相相同的15bp扩展序列；经QIAEXII Gel Extraction Kit回收后，通过PCRCloning Kit将NDPV-VP3基因与PHY.LMV42线性化载体连接。

4.根据权利要求3所述的重组新城疫病毒，其特征在于步骤A)中所述引物序列分别如SEQ ID No.6、SEQ ID No.7所示。

5.根据权利要求3所述的重组新城疫病毒，其特征在于步骤B)中所述引物序列分别如SEQ ID No.8、SEQ ID No.9所示。

6.根据权利要求3所述的重组新城疫病毒，其特征在于VP3基因位于新城疫病毒P基因和M基因之间非编码区。

7.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒，其特征在于步骤B)中将连接产物转化至Stbl2感受态细胞后30℃培养24h，而后通过引物VP3-F、VP3-R进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆。

8.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒，其特征在于所述的重组新城疫病毒为PHY.LMV42嗜肠道型毒株。

9.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒，其特征在于所述的VP3基因来源于新型鸭细小病毒山东分离株。

10.权利要求1所述重组新城疫病毒用于制备鸭细小病毒病、鸭新城疫疫苗抗原的应用。