[发明专利]一种表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其应用

说明书

本发明提供了一种表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其应用，利用已建立的新城疫病毒PHY.LMV42株的反向遗传操作平台，将新型鸭细小病毒的VP3基因ORF插入NDV全长转录载体pLMV‑RFP，构建出重组质粒pLMV‑NDPV‑VP3，该重组质粒与三个辅助质粒共转染BHK‑21细胞后，获得了具有较高繁殖性能的表达NDPV‑VP3蛋白的重组疫苗株rLMV‑NDPV‑VP3。NDPV‑VP3基因位于新城疫病毒P基因和M基因之间非编码区，经反向遗传技术获得重组病毒rLMV‑NDPV‑VP3。该表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒可用于新型鸭细小病毒病和鸭新城疫的预防。

技术领域

本发明涉及反向遗传学应用领域，具体涉及一种表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其应用。

背景技术

2014年以来，在我国山东、安徽、江苏等地鸭群中大面积爆发了一种以生长迟缓、鸭(上下)喙变短、舌头外露下垂、跛行、瘫痪、拉稀以及翅、腿易折断为主要临床特征的传染性疾病，俗称“鸭短喙-侏儒综合征”或“鸭大舌病”。经鉴定该病病原为一种新型鸭细小病毒(novel duck parvovirus，NDPV)，与小鹅瘟病毒亲源关系较近，但二者不处于同一进化分支。鸭短喙-侏儒综合征主要发生于10-25日龄肉鸭，发病鸭常因采食和饮水困难而消瘦，甚至死亡，发病率20％-30％，甚至高达50％，给养鸭业造成了巨大的经济损失。因此，迫切需要开发相关疫苗用于该病的防控。

新城疫(Newcastle Disease，ND)是危害养禽业的重要传染病之一，近年来，新城疫对鸭的危害日趋严重。疫苗接种和严格的生物安全措施是控制新城疫的主要措施。新城疫病毒在靶器官中定向增殖，分为嗜呼吸道毒株和嗜消化道毒株，嗜呼吸道毒株主要有Mukteswar株、HB1株、F株、LaSota和LaSota克隆株等。嗜消化道毒株主要有V4株、VG/GA株、Ulster 2C株和PHY.LMV42株等。一些新城疫弱毒株如LaSota、B1、VG/GA已被广泛用于新城疫的防控。

随着反向遗传操作技术的深入发展，新城疫病毒活载体疫苗得到广泛的研究和应用。重组新城疫病毒作为活载体疫苗具有突出的优点，不仅可以诱导体液免疫和细胞免疫，还可在体内增殖并长期表达抗原基因，且不会与宿主基因组整合，安全性要优于DNA病毒载体。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其应用，以解决现有技术中缺乏一种NDPV-VP3蛋白制备方法的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是采用基于重组技术制备NDPV-VP3蛋白时，该蛋白基因在重组载体上的表达效率较低。

本发明要解决的再一技术问题是现有技术在制备NDPV、NDV二联疫苗时需要分别制备抗原。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒，该重组新城疫病毒是通过以下方法构建的：

1)取鸭细小病毒，利用RT-PCR方法扩增得到NDPV-VP3基因，回收PCR产物，连接至pMD18-T-Vector；

2)将NDPV-VP3基因与pLMV-RFP线性化载体相连接，并将连接产物转化至Stbl2感受态细胞，筛选出阳性克隆，即得到重组NDV病毒质粒；

3)将表达T7聚合酶的重组痘病毒vTF7-3以MOI＝3的滴度接种于单层BHK-21细胞的24孔板内，孵育1h后，将pLMV-VP3、pcDNA-NP、pcDNA-P及pcDNA-L质粒共转染BHK-21细胞，转染72h后，将收获拯救的重组病毒接种10日龄SPF鸡胚，收获HA、HI检测均为阳性的鸡胚尿囊液，即得到重组新城疫病毒rLMV-NDPV-VP3。