[发明专利]一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法及专有试剂

权利要求书

1.一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法，包括收集受精卵、获取胚胎组织和细胞、胚胎细胞的原代培养，其特征在于：

收集受精卵步骤为：选择健康乌贼亲体，按雌雄比1:1分别暂养于水池内，充气、遮光，将乌贼产卵基放入池内收集受精卵，在海水温度为16-20℃、盐度为29-31、pH为7.0-8.0、光照度为4.1-13.1lx的条件下培养，在产卵开始至产卵后50-70min内将受精卵取出，置于玻璃水槽中孵化，在海水温度为22-24℃、盐度为29-31、pH为7.8-8.6的条件下培养2-3d，连续充氧，备用；

所述获取胚胎组织和细胞步骤为：将受精卵消毒，用镊子将卵膜撕裂，释放出胚胎和卵黄，在超净工作台内将胚胎移至培养皿中，剪碎，在1000-1200r/min下离心3-5min，获得胚胎组织沉淀，沉淀中加入2-3μg/mL的胰蛋白酶溶液悬浮胚胎组织，在30-40℃下消化3-5min，再加入与胰蛋白酶溶液等体积的原代培养专有试剂终止胰蛋白酶消化，在1000-1200r/min下离心3-5min，去除上清液，获得消化后的胚胎组织和细胞沉淀；

所述原代培养专有试剂由以下组分组成：培养基溶液、甲基纤维素、D-葡萄糖、小牛血清、乌贼血清、双抗生素，具体为：等体积的770-790mM NaCl溶液、14-15mM KCl溶液、100-110mM MgCl₂溶液和20-25mM CaCl₂溶液混合均匀，用0.22μm的滤膜过滤除菌，即得培养基溶液；按重量体积比为1mg:75-85mL将甲基纤维素加入培养基溶液中，搅拌均匀得A溶液；按重量体积比为1mg:7.5-8.5mL将D-葡萄糖溶于培养基溶液中得B溶液；再将B溶液按照体积比为1:5加入A溶液中，最后加入其他组分并使得小牛血清终浓度为3-5%、乌贼血清终浓度为0.6-0.8%、双抗生素终浓度为0.8-1.2mg/100ml，混合均匀，即得；

所述获取胚胎组织和细胞步骤中受精卵的消毒方法为：依次用浓度为70-80%的乙醇溶液浸泡10-20min，pH为7.0-8.0的无菌PBS溶液冲洗4-6次，含0.62-0.72%的双抗生素和0.28-0.38%的氧氟沙星的无菌水浸泡20-40min，70-80%的乙醇溶液漂洗5-10s，pH为7.0-8.0的无菌PBS溶液洗涤冲洗4-6次；

所述氧氟沙星中含有1.8-2.5%的右旋氧氟沙星；

所述胰蛋白酶的加入量为2-3μg/mL，消化温度为30-40℃，时间为3-5min。

2.根据权利要求1所述的一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法，其特征在于：所述胚胎细胞的原代培养步骤为：用原代培养专有试剂悬浮胚胎组织和细胞沉淀，转移到培养板中，用Parafilm封口膜包好，然后在20-30℃的恒温培养箱中培养，第2天，待组织和细胞贴壁后，更换专有试剂，并视细胞生长情况，每隔5-8d更换一次专有试剂，20-40d后即可得到乌贼细胞群。

3.根据权利要求2所述的一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法，其特征在于：所述胚胎细胞的原代培养步骤中每个孔处理30-40枚受精卵，专有试剂用量为100-150μl。

4.一种乌贼胚胎细胞的原代培养的专有试剂，其特征在于：所述专有试剂由以下组分组成：培养基溶液、甲基纤维素、D-葡萄糖、小牛血清、乌贼血清、双抗生素；

所述专有试剂的制备方法为：

1)将等体积的770-790mM NaCl溶液、14-15mM KCl溶液、100-110mM MgCl₂溶液和20-25mM CaCl₂溶液混合均匀，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，即得培养基溶液，备用；

2)按重量体积比为1mg:75-85mL将甲基纤维素加入培养基溶液中，在2-5℃下搅拌3-4h，得A溶液，备用；

3)按重量体积比为1mg:7.5-8.5mL将D-葡萄糖溶于培养基溶液中得B溶液，再将B溶液按照体积比为1:5加入A溶液中，然后再加入小牛血清、乌贼血清和双抗生素，使得小牛血清终浓度为3-5%，乌贼血清终浓度为0.6-0.8%，双抗生素终浓度为0.8-1.2mg/100ml，混合均匀，即得专有试剂。