[发明专利]一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法及专有试剂

说明书

本发明公开了一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法及专有试剂，原代培养方法包括收集受精卵、获取胚胎组织和细胞、胚胎细胞的原代培养。原代培养专有试剂具体包括以下组分：培养基溶液、甲基纤维素、D‑葡萄糖、小牛血清、乌贼血清、双抗生素。有益效果为：本发明原代培养方法分离所得的细胞数量较多，消毒彻底，能够减少分离时对胚胎的损伤，胚胎细胞贴壁生长量多、培养的成功率高、存活时间长；专有试剂能够刺激细胞自身更多地分泌生长因子，加快胚胎细胞的分裂，缩短细胞培养时间。

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，尤其是涉及一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法及专有试剂。

背景技术

曼氏无针乌贼（Sepiella maindroni）属于软体动物门Mollusca、头足纲Cephalopoda、二鳃亚纲Dibranchia、乌贼目Sepioidea、乌贼科Sepiidae、无针乌贼属Sepiella。曼氏无针乌贼的是一种高蛋白、低脂肪、营养较全面的海产品。它的经济价值很高，其可食用部分占总体的92%。它的肉质洁白，营养丰富，含有优质蛋白质和丰富微量元素，味道鲜美,经常食用可以聪明延智、延缓衰老、提高造血和免疫功能,对防止心血管疾病、贫血和肿瘤有一定的作用。但是随着对产卵群体的围捕以及张网作业对幼体乌贼的损害，捕捞强度的加大，使乌贼群体不能获得有效的补充，再加上自然环境的污染和破坏，从20世纪80年代末开始出现曼氏无针乌贼资源的急剧衰退，渔讯难再形成。曼氏无针乌贼是最近几年才得以规模化繁育及增养殖开发的重要头足类种类。但是乌贼的全人工繁育技术还存在许多问题，例如：由于内源性营养向外源性营养转变过程中初孵仔乌的成活率较低；初孵仔乌需要活体饵料，幼体和成体缺乏人工饵料；集约养殖条件下，养殖环境的调控等，所以目前养殖乌贼的经济成本仍较高。

随着生命科学的迅猛发展，在生物工程技术领域中，细胞工程已愈来愈受到重视。从某种意义上说，基因工程是现代生物技术的核心，而细胞工程是现代生物技术的基础和公用平台。细胞培养是开展细胞学基础研究、细胞结构与功能验证及细胞工程学研究必不可少的研究手段。海洋生物细胞培养研究由于起步较晚，同时海洋生物细胞培养条件因生活环境的巨大差异也与陆地生物差别较大，目前海洋生物细胞培养技术在很多种类上尚未成熟。但有关头足类乌贼体外条件下的细胞培养技术还未攻克，因而严重影响以细胞培养为基础的相关研究，因此迫切开发出一种稳定有效的细胞培养方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种分离所得的细胞数量较多，消毒彻底，减少分离时对胚胎的损伤，胚胎细胞贴壁生长量多、培养的成功率高、存活时间长的乌贼胚胎细胞的原代培养方法。

本发明的目的之二在于提供一种加快胚胎细胞的分裂，缩短细胞培养时间，能够刺激细胞自身更多地分泌生长因子，使得胚胎细胞在初期细胞贴壁期间表现更好，能快速从贴壁的组织块中开始迁移出来，继续生长的乌贼胚胎细胞的原代培养专有试剂。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法，包括收集受精卵、获取胚胎组织和细胞、胚胎细胞的原代培养，具体包括如下步骤：

收集受精卵：选择健康乌贼亲体，按雌雄比1:1分别暂养于水泥池内，充气、遮光，将乌贼产卵基放入池内收集受精卵，在海水温度为16-20℃、盐度为29-31、pH为7.0-8.0、光照度为4.1-13.1 lx的条件下培养，在产卵开始至产卵后50-70min内将受精卵取出，置于玻璃水槽中孵化，在海水温度为22-24℃、盐度为29-31、pH为7.8-8.6的条件下培养2-3d，连续充氧，备用，早期胚胎卵黄占据了胚胎的绝大部分，分离后，离心收集到离心管中的多为卵黄和细胞的混合物，较难分离获得胚胎细胞，而受精2-3d的胚胎较容易进行原代细胞分离，分离所得的细胞数量也较多，成功率更高；