[发明专利]一种用于检测胶基型嚼烟对细胞活性氧分泌影响的方法

权利要求书

1.一种用于检测胶基型嚼烟对细胞活性氧分泌影响的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；

步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；

步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为200μL/孔接种到细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%CO2培养箱内培养24h；

步骤（5），受试物暴露：受试物分为两组：阳性对照组和样品测试组；移除步骤（4）中细胞培养板内的培养基，再按上述方法进行分组；在阳性对照组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和浓度为50mg/ml的ROS阳性物Rosup 100μl；在样品测试组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和不同剂量的步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%；阳性对照组和样品测试组的终体积为200μL/孔；之后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24h；

步骤（6），装载探针：除去步骤（5）细胞培养板中的细胞培养基，每孔加入浓度为10μmol/L的DCFH-DA 探针100μl，37℃、5%CO2培养箱中孵育1h；

步骤（7），样品测定：除去步骤（6）细胞培养板中的液体，用PBS缓冲液洗多次，用荧光酶标仪于488nm激发波长下测定各个孔的光度值；

步骤（8），活性氧水平计算：

根据（7）获得的光度值，按照下列公式计算活性氧水平：

若刺激后OD值升高则计算活性氧升高率来表示活性氧水平：活性氧升高率=（刺激后OD值-刺激前OD值）/刺激前OD值×100%；

若刺激后OD值降低则计算活性氧降低率来表示活性氧水平：活性氧降低率=（刺激前OD值-刺激后OD值）/刺激前OD值×100%；

之后，将样品测试组的活性氧水平与细胞对照组的活性氧水平相比，如有显著差异，且样品测试组的剂量与样品测试组的活性氧水平之间有剂量反应关系的，即为阳性结果，该胶基型嚼烟影响细胞的活性氧分泌；

将样品测试组的活性氧水平与细胞对照组的活性氧水平相比，如无显著差异，且样品测试组的剂量与样品测试组的活性氧水平之间无剂量反应关系的，则为阴性结果，该胶基型嚼烟不影响细胞的活性氧分泌。

2.根据权利要求1所述的用于检测胶基型嚼烟对细胞活性氧分泌影响的方法，其特征在于，步骤（1）所述的研磨方式具体为：研磨棒顺时针研磨1min后逆时针研磨1min，交替进行，研磨速度为30rpm/min。

3.根据权利要求1所述的用于检测胶基型嚼烟对细胞活性氧分泌影响的方法，其特征在于，步骤（1）所述的过滤方法为先用定性滤纸进行初滤，再用0.45μm有机滤膜过滤。

4.根据权利要求1所述的用于检测胶基型嚼烟对细胞活性氧分泌影响的方法，其特征在于，步骤（4）所述的细胞培养板为96孔细胞培养板。

5.根据权利要求1所述的用于检测胶基型嚼烟对细胞活性氧分泌影响的方法，其特征在于，步骤（5）分组时，样品测试组的各个浓度和阳性对照组均设置4个复孔。

6.根据权利要求1所述的用于检测胶基型嚼烟对细胞活性氧分泌影响的方法，其特征在于，步骤（7）中，用PBS缓冲液洗3次。