[发明专利]一种用于检测胶基型嚼烟对细胞活性氧分泌影响的方法

说明书

本发明涉及一种用于检测胶基型嚼烟对细胞活性氧分泌影响的方法，属于烟草及烟草制品生物学效应评价技术领域。该方法包括样品前处理、单细胞悬液的制备、单细胞悬浮液的细胞浓度计算、细胞接种、受试物暴露、装载探针、样品测定和活性氧水平计算灯步骤。本发明综合考察胶基型嚼烟制品的溶出方式、暴露途径、作用方式，建立了胶基型嚼烟样品前处理方法，样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测胶基型嚼烟对细胞活性氧分泌影响的方法。

技术领域

本发明属于烟草及烟草制品生物学效应评价技术领域，具体涉及一种用于检测胶基型嚼烟对细胞活性氧分泌影响的方法。

背景技术

随着人们对健康的关注越来越高，对烟草产品提出了更高的要求，不但要有较好的口感，而且要尽可能的减少人体的不良感受。口含烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。根据产品的组分及形态特点，口含烟制品分为传统含烟叶原料的Snus型口含烟和不含烟叶原料的新型口含烟（如胶基型嚼烟）。口含烟研发人员在产品配方设计初期将不同组份按照不同比例组合调配，形成具有不同风格的初选配方，再结合化学评价和感官评价对配方进行不断筛选调整形成最终的产品配方。然而初选配方数量众多，全部进行感官评价耗时耗力，且感官评价侧重于对产品的风格口感进行筛选，如何利用生物学测试指标对产品初选配方进筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方，目前尚属探索阶段，无统一的标准方法。

机体在遭受各种不利刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygenspecies,ROS)产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。这种现象被称为氧化性损伤，氧化性损伤是一种广谱性损伤机制，活性氧是氧化性损伤的一种重要效应生物标志物，对其进行测定，可用于产品初选配方的进一步筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方。

胶基型嚼烟是一种以烟草或烟草提取物为有效组分，以可食用胶基为载体，通过咀嚼方式向人体递送烟碱的新型烟草制品。咀嚼过程中烟草或烟草提取物及其他食品添加剂缓慢释放到唾液中，其释放方式有别于传统卷烟和含烟叶原料的Snus型口含烟，因此，有必要针对胶基型口含自身特点建立适合胶基型嚼烟对细胞活性氧分泌影响的评价方法。

发明内容

本发明的目的正是针对上述技术问题，对胶基型嚼烟对细胞活性氧分泌影响进行了综合研究，确定了胶基型嚼烟的检测剂量，以及胶基型嚼烟前处理方法，制定了一种适用于检测胶基型嚼烟对细胞活性氧分泌影响的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于检测胶基型嚼烟对细胞活性氧分泌影响的方法，包括如下步骤：

步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；

步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；

步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；