[发明专利]一种非诊断目的的大肠埃希氏菌O157:H7的快速检测方法

权利要求书

1.一种非诊断目的的大肠埃希氏菌O157:H7的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用鼠抗大肠埃希氏菌O157:H7抗体对Fe₃O₄/SiO₂核壳结构的磁性纳米颗粒表面进行修饰，得到免疫磁性探针；

(2)将Au-Pt纳米微球修饰到二氧化硅纳米颗粒(SiNPs)表面，得到Au-Pt-SiO₂复合纳米微球(APS NPs)；

(3)以步骤(2)制备得到的Au-Pt-SiO₂复合纳米微球(APS NPs)为载体结合大肠埃希氏菌O157:H7抗体和蔗糖酶，得到信号转导探针；

(4)取待测样品，用血糖仪检测待测样品中的葡萄糖初始浓度C1，然后将步骤(1)制备得到的免疫磁性探针加入到待测样品的菌悬液中于37℃孵育一定时间，经洗涤、磁性分离，将磁性复合物A分离出来；

(5)在步骤(4)分离得到的磁性复合物A中加入步骤(3)制备得到的信号转导探针并于37℃孵育一定时间，经洗涤、磁性分离，将磁性复合物B分离出来；

(6)在步骤(5)得到的磁性复合物B中加入蔗糖溶液，在55℃下静置反应一定时间后用血糖仪检测体系的葡萄糖浓度C2；根据葡萄糖浓度的变化差值ΔC为纵坐标，大肠埃希氏菌O157:H7浓度的对数值为横坐标的标准曲线，能够计算出样品中大肠埃希氏菌O157:H7的含量，其中，ΔC＝C2-C1。

2.如权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的磁性纳米颗粒通过如下方法制备而得：

(1)将聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐(PSSMA)溶于乙二醇中，磁力搅拌得到均匀的橙色溶液；再加入六水合三氯化铁和无水醋酸钠；接着，将得到的红棕色均一液体倒入到水热反应釜中，200℃反应10h；待冷却到室温后，将所得黑色Fe₃O₄沉淀物在外磁场作用下用超纯水洗涤至少三次；

(2)取Fe₃O₄溶液置于锥形瓶中，向其中加入乙醇，去离子水和氨水，混合搅拌后，再加入正硅酸四乙酯(TEOS)，在室温下搅拌反应18h；然后在外磁场作用下依次用乙醇和蒸馏水洗涤多次，最后分离得到的沉淀物即为磁性纳米颗粒。

3.如权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中免疫磁性探针的具体制备步骤如下：首先取磁性纳米颗粒并用无水乙醇洗涤，将洗涤后的磁性纳米颗粒重悬于乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温下搅拌反应12h后，磁性分离并分别使用乙醇和磷酸盐缓冲液洗涤多次，得到氨基修饰的磁性纳米颗粒；同时，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到用磷酸盐缓冲液稀释的鼠抗大肠埃希氏菌O157:H7单克隆捕获抗体中，4℃过夜孵育；再加入溶于磷酸盐缓冲液的氨基修饰的磁性纳米颗粒，室温震荡反应4h，磁性分离并用磷酸盐缓冲液洗涤多次，得到表面修饰有鼠抗大肠埃希氏菌O157:H7抗体的磁性纳米颗粒。

4.如权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的二氧化硅纳米颗粒通过如下方法制备而得：

将正硅酸四乙酯加入到乙醇中得到A液，将氨水和乙醇加入到水中得到B液，再将A液迅速地加入到B液中，室温条件下反应5h；结束后，离心分离，用无水乙醇和蒸馏水分别洗涤多次。