[发明专利]一种目标区域多重PCR与快速文库构建的方法

说明书

本发明属于遗传学与精准医学领域，涉及到一种靶向特异区段超高重PCR与快速文库构建的新方法。本发明能在2‑3小时内,由2.5‑50ng经提取的DNA为模板获得符合下游分析要求的高质量文库，并且在建库过程中引物端自动加上样本区分barcode，无需二次建库。下机数据各扩增子均一性高，1M Reads前提下，99.5％扩增子上的热点达到1200X覆盖；特异性高，100％的靶序列均能被有效扩增。本发明文库接头的添加具有方向性，可提高数据利用率和文库质量。

技术领域

本发明属于遗传学与精准医学领域，涉及到一种靶向特异区段超高重PCR与快速文库构建的新方法。

背景技术

多重PCR技术在遗传学与精准医学领域最大的价值在于它能提高诊断的敏感性。敏感性可以从两方面分析：检测敏感性和临床敏感性。

检测敏感性强调的是检测结果：如果标本中含有被检测物，检测成功的几率是多少。如果是PCR反应，就是能检测到的最低拷贝数。临床敏感性是从临床角度看问题：实验结果给病人出诊断的成功率有多高。如果一个病仅有一个病因，检测敏感性和临床敏感性无差别。如果疾病的诊断需要同时分析多病因，仅对一个指标进行检测，检测敏感性再高其临床敏感性也要大打折扣。qPCR的检测敏感性是无可争议的，可是因为无法做多重，所以临床敏感性不够好。而多重PCR临床敏感性要高很多。

精准医学时代，靶向特异区段重测序的需求日益增加，样本量常达上千，只用传统的Sanger法或目标区域杂交捕获测序价格昂贵。因此基于多重或超高重PCR的扩增子测序适用性强，可以针对连续区段，外显子靶标以其他指定位点，设计特异引物，一次获得所有位点，有着重要的临床意义和广泛的应用前景，但是仍然存在很多限制性因素，其中多重PCR扩增效率的一致性一直是最大的难题，扩增子越多、不均一性越高等。

本领域需要解决多重PCR扩增效率的一致性。

发明内容

本发明旨在通过多重PCR快速构建DNA文库并解决其中多重PCR扩增效率的一致性问题。具体地：

本发明提供一种通过多重PCR扩增DNA并构建文库的方法，包括：

(1)获取样本DNA

(2)使用添加了锚定接头且经过修饰的特异性引物对的集合，对步骤(1)得到的样本DNA进行第一轮PCR，所述特殊接头为且经过修饰的特异性引物对具有如下结构:

5’修饰的锚定接头序列+针对待扩增区域的特异性序列

(3)不添加新的引物，将步骤(2)得到的产物在新的反应体系中进行第二轮PCR，使得全部引物被用于扩增，

(4)使用特殊设计的文库构建引物对，以所述特异性引物对上的特殊接头为引物锚定区域，进行扩增的同时在包含目标基因/区段的扩增子两端加上文库接头，所述文库构建引物对包含的引物具有如下结构(5’到3’)

5’修饰的文库接头+锚定接头序列

(5)构建文库。

在一个实施方案中，所述特异性引物对的集合包括50-2000个引物对。

在一个实施方案中，所述待扩增区域的特异性序列的长度为5-20kb个碱基。

在一个实施方案中，步骤(2)所述的5’修饰是NH2-C6修饰。

在一个实施方案中，步骤(2)中正向引物的锚定接头序列为：

5’-NH2-C6-GCTCTTCCGATCTMM(SEQ ID NO:1)，M为A或C；

步骤(2)中反向引物的锚定接头序列为：

5’-NH2-C6-GCTCTTCCGATCTKK(SEQ ID NO:2)，M为G或T。