[发明专利]一种小菜蛾识别蛋白PxIDGF制品及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种小菜蛾识别蛋白PxIDGF制品在抵御微生物侵染中的应用，其特征在于，所述识别蛋白PxIDGF制品具有结合微生物、凝集微生物的能力，所述微生物为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌；

所述小菜蛾识别蛋白PxIDGF制品是从小菜蛾幼虫中通过基因克隆、蛋白表达、纯化得到的一种蛋白制品，理论分子量为 47.904KD，等电点为7.67；所述蛋白制品的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述小菜蛾识别蛋白PxIDGF制品在抵御微生物侵染中的应用，其特征在于，所述小菜蛾识别蛋白PxIDGF制品的制备方法，包括以下步骤：

（1）pCzn1- IDGF质粒构建；

（2）pCzn 1-IDGF载体转化至大肠杆菌 Arctic-Express；

（3）IPTG 诱导 pCzn 1-IDGF载体融合蛋白的表达；

（4）包涵体蛋白的变复性；

（5）融合蛋白的Ni柱亲和纯化。

3.根据权利要求2所述小菜蛾识别蛋白PxIDGF制品在抵御微生物侵染中的应用，其特征在于，所述步骤（1）pCzn1- IDGF质粒构建方法如下：从小菜蛾四龄幼虫体中提取总RNA，逆转录合成第一链cDNA，设计用于扩增小菜蛾识别蛋白PxIDGF基因的一对上、下游引物，设计的引物中引入酶切位点，利用设计的引物从cDNA中扩增小菜蛾识别蛋白PxIDGF基因，利用常规分子克隆的方法将获得的线性化目的基因小菜蛾识别蛋白PxIDGF与目标载体pCzn1连接，连接产物转化TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，筛选获得测序正确的阳性克隆，提取质粒；

所述上游引物序列为5’-GGAATTCCATATGAACCAGGTCGTCTCC -3’，核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，

下游引物序列为5’- GCTCTAGATTACAGACGGTACTTGG -3’，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.根据权利要求2所述小菜蛾识别蛋白PxIDGF制品在抵御微生物侵染中的应用，其特征在于，所述步骤（2）pCzn 1-IDGF载体转化至大肠杆菌 Arctic-Express的方法为：将测序正确的阳性克隆提取质粒，将1 μL质粒加入 100 μL 感受态细菌中，置冰上 20min；42℃热激 90 s迅速置冰中 5 min；加入 600μL LB 培养液； 37℃，220 rpm 振摇 1 h，离心后全部涂布于含 50 μg/ml Amp 的 LB 平板，37℃倒置培养过夜。

5.根据权利要求2所述小菜蛾识别蛋白PxIDGF制品在抵御微生物侵染中的应用，其特征在于，所述步骤（3）pCzn 1-IDGF载体融合蛋白的表达方法为：挑取转化平板上的单克隆接种于含50 μg/ml AMP的3 ml LB培养液的试管中，37℃，220 rpm振摇过夜；次日按1：100接种于50 μg/ml AMP的30 ml LB培养液中，37℃ 220 rpm振摇至菌体OD₆₀₀为0.6-0.8；加入IPTG至终浓度为0.5 mM，15℃，220 rpm振摇过夜，诱导融合蛋白表达；在4000g条件下，离心10 min，弃上清，收集沉淀。