[发明专利]一种小菜蛾识别蛋白PxIDGF制品及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种小菜蛾识别蛋白PxIDGF制品及其制备方法和应用，所述蛋白制品的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。从小菜蛾四龄幼虫体中提取总RNA，逆转录合成第一链cDNA，利用设计引物从cDNA中扩增小菜蛾识别蛋白PxIDGF基因，将小菜蛾识别蛋白PxIDGF基因克隆到pCzn1载体中，然后将重组质粒转入到大肠杆菌Arctic‑Express表达菌株，诱导融合蛋白表达，通过变复性的方式，重溶目标蛋白，通过Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。本发明制备的小菜蛾识别蛋白PxIDGF制品纯度高、活性高，具有结合和凝集大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的能力。本发明可为深入研究小菜蛾识别蛋白PxIDGF的应用打下技术基础。

技术领域

本发明属于昆虫天然免疫识别领域，特别涉及一种小菜蛾识别蛋白PxIDGF制品及其制备方法和应用。

背景技术

作为世界上农作物有害生物危害最严重的国家之一，我国的重大农业害虫有30种之多，危害严重，损失惊人。小菜蛾(Plutella xylostella)便是其中一种。作为一种危害十字花科植物的世界性农业害虫，已对拟除虫菊酯类、有机磷及氨基甲酸酯类等许多杀虫剂产生了显著抗药性。它是首个对DDT产生抗性的作物害虫，也是首个对苏云金杆菌毒素产生抗性的昆虫(Baxter等，2010)。因此迫切需要研究新的小菜蛾防治途径。而发展生物防治技术是持久高效控制小菜蛾危害的必然趋势。目前利用昆虫病原菌或病原菌产生的毒力因子来防治害虫是害虫生物防治研究的前沿之一，其成功的关键在于了解寄主昆虫的免疫防御机制。因此阐明小菜蛾对各种病原物的免疫反应机制可为新的害虫控制方法提供理论基础。

由于缺乏获得性免疫，昆虫主要依靠其自身的天然免疫来抵御各种病原物的入侵。昆虫的天然免疫包括细胞免疫和体液免疫。昆虫如失去天然免疫的保护，其生存将受到影响。有研究表明先天免疫缺陷的昆虫(基因突变所致)或人为的抑制昆虫的天然免疫，昆虫对病原物的抵抗力将减弱。体液免疫中，从病原物侵袭到最终被寄主清除一般要经过如下过程：首先是识别外来异物；随后引发激活丝氨酸蛋白酶和解除丝氨酸蛋白酶抑制剂的细胞外级联反应；然后引发信号转导途径而激活目的基因转录。这个过程需要4个重要因子，即识别分子、信号调节因子、信号转导系统及效应分子。

病原识别是启动昆虫体液免疫的关键第一步，主要是由不同识别分子来完成。识别分子，又称模式识别蛋白，是昆虫免疫应答的关键因子，可以识别病原物的细胞壁成分(即病原分子相关模式pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，诸如革兰氏阴性细菌的脂多糖，革兰氏阳性细菌的肽聚糖、真菌的β-1,3-葡聚糖和病毒的双链RNA。不同的识别分子具有不同的结构和功能，结合不同的PAMPs。模式昆虫双翅目果蝇目前已经鉴定出的识别分子超过8种，主要有肽聚糖识别蛋白(PGRPs)、硫脂蛋白、革兰氏阴性细菌结合蛋白(GNBPs)、β-1,3-葡聚糖识别蛋白(βGRPs)、清道夫受体、C型凝集素、半乳糖凝集素和免疫球蛋白等。正是由于天然免疫对于昆虫的生存具有极其重要的影响，其已经成为害虫控制的一个重要靶标。目前昆虫天然免疫中识别分子的研究已成为免疫学研究的重点和热点。

为探讨小菜蛾对病原真菌入侵的免疫防御机制，我们对病原生物侵染小菜蛾幼虫的转录组进行了测序，并对免疫相关基因进行了筛选。鉴定出一些可能参与到小菜蛾免疫病原生物侵染的免疫基因，包括：识别分子、信号调节因子、抗菌效应因子和其它一些可能参与免疫的基因等。其中识别分子包括PxIDGF、CTL(C-type lectins)和PGRP(peptidoglycan recognition protein)等。IDGF，即器官芽生长因子，隶属于糖基水解酶第18家族，由昆虫脂肪体表达分泌到昆虫的血淋巴中，其主要功能是调节昆虫发育和生长。由于具有1个结合几丁质的凝集素结构域和1个结合几丁质的乳酸结构域而被推测可能在无脊椎动物的病原识别上起作用。关于此功能目前并未有实验数据证明。

为了明确在小菜蛾体液免疫病原微生物的过程中小菜蛾识别蛋白PxIDGF是否具有免疫识别作用，获得有活性的该蛋白非常必要。目前并未有小菜蛾识别蛋白PxIDGF的制品及制备方法方面的发明。

发明内容